Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 15

100,0 г измельченного сырья заливают таким же количествомэкстрагента для смачивания и набухания в отдельной плотно закрытойемкости на 4 часа. Затем сырье переносят в перколятор, заливают однойтретью оставшегося экстрагента и оставляют на 24 часа.Этап 2. Сливают первое концентрированное извлечение, котораясоставляет 85% от общей массы сырья (85 грамм). После чего заливаютвторую порцию экстрагента и оставляют на 24 часа.Этап 3.

Сливают из перколятора второе извлечение и отжимают сырье.Затем заливают третью порцию экстрагента и оставляют на 24 часа.Этап 4. Сливают третье извлечение и отжимают сырье. После чегообъединяют второе и третье извлечения и упаривают под вакуумом притемпературе от 50 до 60С до получения 15% от массы сырья. Объединяютостаток после упаривания с первым концентрированным извлечением иотстаивают 2-3 дня при 8 0С.Этап 5. Извлечение фильтруют, проверяют по показателям качества ифасуют в емкости из темного стекла, маркируют.971. ПодготовкаоборудованияИзмельчение ЛРС2. Подготовка сырья иэкстрагентаПросеивание ЛРСПодготовка экстрагента3.

Получение жидкогоэкстрактаНамачивание ЛРСНастаивание с 1/3экстрагентаI. Слив (85% от массыЛРС)4. Объединение ивыпаривание (до 15% отмассы ЛРС)II. Слив (полностью) иотжимIII. Слив (полностью) иотжимШрот5. Объединение с первойвытяжкойРегенерацияспирта (отгонка)Отстаивание6. ОчисткаФильтрование7. Упаковка и маркировкаУпаковка во флаконыМаркировкаСпирт.отгонШротПриготовлениеэкстрагентаОтходРисунок 4.1. Схема способа получения жидкого экстракта (1:1) I.viscosa«Жэтривис»Дляудобствадальнейшегоописанияэтаповразработкиистандартизации полученного препарата ему было присвоено наименование «Жэтривис» - Жидкий экстракт из травы Inula viscosa.4.1.3 Стандартизация жидкого экстракта I.viscosa (1:1) «Жэтривис»Стандартизация жидкого экстракта осуществлялась согласно принципусквозной стандартизации от сырья к препарату.98Количественное определение содержания суммы флавоноидов впересчете на рутин осуществлялось после реакции комплексообразования схлоридом алюминия.

Спектры поглощения комплексов флавоноидов изэкстракта и СО рутина в интервале длин волн 404- 412 нм имеют совпадающиемаксимумы, как и в случае извлечения из сырья, поэтому, в качествеаналитической выбрана длина волны 410 нм (Рис.4.2).Рисунок 4.2. УФ-спектр рутина (1) и растворов комплексовфлавоноидов в экстракте с реактивом AlCl3 (2)Методика и расчеты осуществляется в соответствии с описанием,изложенным в п.3.6.2, и полностью приведена в приложении 8. Содержаниесуммы флавоноидов в исследованных образцах экстракта в пересчете на рутинсоставило не менее 1,9 %.Метрологические характеристики методики приведены в таблице 4.4,погрешность отдельной варианты c 95% вероятностью не превышает 4,25%.Таблица 4.4 - Метрологические характеристики результатов количественногоопределения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин в экстракте.n fP(%)T (P,f)X%S2SSxXсрX6 5952,571,9581,052 х10-33,243 х10-21,324 х10-23,40 х10-28,33 х10-2Ē % Eср%4,251,7499Проведен обсчет метрологических характеристик, установлено, чтопогрешности опыта не превышают предельно допустимых значений.

Данноеобстоятельство позволяет судить о приемлемости данной методики длястандартизации экстракта.Показатели качества экстракта «Жэтривис» определены на 6 серияхпрепарата и приведены в таблице 4.5Таблица 4.5 – Номенклатура показателей качества «Жэтривис»Показатель качестваОписаниеЖидкий экстракт Inula viscosa1:1 - «Жэтривис»Жидкость от зелено-коричневого цвета с легкойопалесценцией и характерным запахомПодлинность:Зоны голубого цвета хлорогеновая и кофейная кислоты (RfТСХ (сорбент силикагель в около 0,51 и 0,75 соответственно), зона коричневого цветасистеме н-бутанол - кислота рутин (Rf около 0,58). После опрыскивания: зоны синеуксусная ледяная – вода зеленоватого цвета хлорогеновая и кофейная кислоты (Rf(4:1:1))около 0,51 и 0,75 соответственно), зона оранжевого цветарутин (Rf около 0,58).

Допускается наличие других зонадсорбции. В соответствии со стандартом.КоличественноеСодержание не менее 1,96содержание флавоноидов впересчете на рутин, %УФ-СФМ при длине волны410 нм.Содержаниеспирта Не менее 48этилового, масс %ОФС.1.2.1.0016.15Плотность, г/см30,964 – 0,970Сухой остаток, %Не менее 30МикробиологическаяКатегория 4Б – в соответствии, с требованиями ГФчистотаСодержаниетяжелых Не более 0,01металлов, %По разработанным показателям качества на 6 образцах «Жэтривис» былопределен его срок годности методом длительного хранения при 25±2°C иотносительнойвлажности(60±5)%.Средниезначениярезультатовисследования стабильности по показателям качества «Жэтривис» приведеныв таблице 4.6.100Таблица 4.6– Показатели качества «Жэтривис» при хранении№12345Наименованияпоказателей качестваТребованиякачествукЗначения числовых показателей0мес.6мес.12мес.18мес.24мес.30мес.СодержаниеНе менее 1,96флавоноидов впересчете на рутин, %Подлинность:Зоны с Rf 0,51;ТСХ0,58; 0,75++++++++++++Тяжелыеметаллы, Не более 0,01мг/кгСпирта, масс %Не менее 48Сухой остаток, %Не менее 30++++++++++++++++++Примечание: знак + обозначает, что образцы соответствуют показателюкачества в соответствии с требованиями проекта НД.На основании полученных данных можно сделать заключение, что после2,5 лет хранения «Жэтривис» соответствует требованиям, заложенным впроекте НД, определенным в результате испытаний.

Следовательно,рекомендуетсясрокгодности«Жэтривис»2года.Порезультатампроведенных исследований разработан проект НД «Жидкий экстракт травыInula viscosa 1:1- Жэтривис», который представлен приложении 9.«Жэтривис»предполагаетсяиспользоватьвкачествеантибактериального и противовоспалительного средства для местного инаружного применения в составе мазевых ЛФ и самостоятельно в видераствора для орошения.

«Жэтривис» разработан для использования в качествесредства для лечения ран, ожогов и других поражений кожи, аналогичноводному настою листьев I.viscosa используемому этномедициной Сирии.1014.2. Обоснование содержания экстракта I.viscosa в составеаппликационных ЛФ методами in vitro и in vivoИспользованиепрепарата«Жэтривис»дляместноголечениябактериальных поражений возможно в виде разбавленного раствора и в видеЛФ гель, наиболее предпочтительной для раневых патологий.

Поскольку, всоставе«Жэтривис»присутствуютБАСпротивовоспалительногоиантимикробного действия необходимо подтвердить степень обоих видовактивности и определить эффективные концентрации.4.2.1 Определение бактериостатической и фунгистатическойактивности «Жэтривис» в опытах in vitroАнтимикробнуюактивность«Жэтривис»определялисогласноописанным в главе 2 методикам, в качестве образцов сравнения и дляисключения ингибирующего действия спирта этилового были использованырастворы спирта 40%, 50% (соответствующие содержанию спирта в экстракте)и 70% (как соответствующий содержанию в экстрагенте).Результатыизучениябактериостатическойифунгистатическойактивности представлены в таблице 4.7.Таблица 4.7 – Антимикробная активность «Жэтривис» в опытах in vitro(разведение)тест-микроорганизмы«Жэтривис»Объекты исследованияСпирт этиловый40 %50%70%Staph.aureus 209 P1:5121:41:41:8-1:12Esch.coli ATCC 259221:641:41:81:10-1:14Pr.vulgaris ATCC 68961:1281:81:81:12Ps.aeruginosa ATCC90271:321:81:81:10Can.albicans ATCC 102311:641:41:41:10Micr.canis 2521:25601:81:81:20102Как видно из представленных в таблице 4.7 данных, наиболее высокойбактериостатической активностью обладает образец «Жэтривис» в отношенииграмположительных бактерий Staph.aureus 209-P в разведении 1:512.

Вотношении грамотрицательных бактерий Esсh.coli АТСС 25922, Pr.vulgarisATCC 6896 и Ps.aeruginosa АТСС 9027 экстракт проявляет умереннуюактивность в разведении 1:32-1:128.При изучении фунгистатического действия установлена высокаяактивность образца в отношении Micr.canis 252 ‒ в разведении 1: 2560 иумеренная – в отношении C.albicans АТСС 10231 в разведении 1:64.Также установлено, что образцы спирта 40% и 50% и 70% не проявлялиантимикробнойактивностипосравнениюобразцом«Жэтривис»,содержащего БАС целевого фрагмента метаблома травы I.viscosa такимобразом, этиловый спирт вносит лишь незначительный вклад.Согласно полученным результатам - «Жэтривис», можно рекомендоватьдля создания на его основе аппликационных лекарственных форм присодержании от 3 % для лечения бактериальных поражений кожи.4.2.2 Установлениепротивовоспалительнойактивностисиспользованием специфической биотест-системы in vitroПротивовоспалительное действие водных извлечений из сырья I.viscosаотмеченное этномедициной Сирии подтверждается теоретическими данными,полученными in silico, в частности, для инувисколида и других БАС целевогофрагментаметаболома.Перспективныминструментомвыявленияиподтверждения биологической активности в комплексе с другими методамиявляютсяспецифическиеферментныебиотест-системы(СФБТС).Вчастности, индуцибельная NO синтаза iNOS, используется для установления(подтверждения) противовоспалительной активности БАС.Вкачествепротивовоспалительнойпрепаратаактивностисравнениявыбранприизвестныйустановленииотечественный103препарат растительного происхождения «Ротокан» (ЗАО «Вифитех», Россия)[13].Для приготовления растворов брали исходные аликвоты 100 мклпрепарата Ротокана (содержит 9 мг вещества сухого остатка) и «Жэтривис»(содержит 30 мг вещества сухого остатка), разбавляли 70% спиртом доконцентрации веществ в растворе - 4 мг/мл, 2 мг/мл и 1 мг/мл.

Приисследовании скорости iNOS-реакции в опытную пробу добавляли по 20 мклиспытуемого раствора. Контроль не содержал испытуемый раствор.В таблице 4.8 представлены результаты сравнительного исследованияскорости ферментативной реакции, катализируемой iNOS in vitro, придобавлении в реакционную пробу 20 мкл исследуемых растворов «Жэтривис»и Ротокана в границах концентрации 4,0 – 1,0 мг/мл.Таблица 4.8 - Изменение кинетики ферментативной iNOS–реакции взависимости от концентрацииВарианты опыта:Контроль(без препарата)iNOS +4,0 мг/млiNOS +2,0мг/млiNOS +1,0 мг/млКинетика ферментативной iNOS-реакцииСнижение скорости реакции внмоль НАДФН/минопыте по сравнению сна мг белкаконтролем (%)Ротокан«Жэтривис»Ротокан«Жэтривис»4,256 ± 0,0304,256 ± 0,0261001003,080 ± 0,0153,350 ± 0,0263,735 ± 0,0230,231 ± 0,0040,385 ± 0,0031,933 ± 0,02372,478,787,83,19,145,2Из данных, представленных в таблице 4.8, следует, что препаратсравнения Ротокан показал противовоспалительную активность, так как взначительной степени снижает скорость ферментативной iNOS–реакции, вконцентрации 4,0 мг/мл на 27,6%, в концентрации 2 мг/мл на 21,3 %, а вконцентрации 1 мг/мл на 12,2%.Тем более значительно выглядят результаты ингибирующего влияния наскорость ферментативной iNOS–реакции «Жэтривис».