Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 12

Метаболиты извлечения из сырья I.viscosa приразличных способах проявления хроматограммыПосле опрыскивания хроматограммы растворами реактивов придневном свете на ней проявляются три интенсивно окрашенные зоныфлавоноидов: с Rf около 0,58 (соответствует рутину) и с Rf около 0,69 и с Rfоколо 0,78 (два не идентифицированных вещества). На хроматограмме придлине волны 365 нм, зоны адсорбции сине-зеленоватого цвета принадлежатфенолкарбоновым кислотам, а зоны оранжевого цвета соответствуютфлавоноидам (Rf около 0,58, 0,68 и 0,77) –. Фиолетовую флуоресценцию на74хроматограммеимеетзонаадсорбцииСОгалловойкислоты,носоответствующая ей зона, на хроматограмме испытуемого извлеченияокрашена слабо, из-за наложения на зоны других веществ.Таким образом, изучение извлечения из сырья I.viscosa методом ТСХпозволило установить присутствие фенольных веществ, превалирующее (судяпо площади зон и их интенсивности окрашивания и флуоресценции)содержание среди которых имеют фенолкарбоновые кислоты, в частностихлорогеновая, кофейная и галловая, а также флавоноиды (рутин).3.4.2 Изучение фитохимического состава травы I.

viscosa методомУВЭЖХ/МСДля изучения БАС, извлекаемых из травы I.viscosa, согласно методике,изложенной в разделе 2.2.2.2, получены четыре фракции 1-ая - водная, 2-ая бутанольная, 3-я – этилацетатная и 4-ая - хлороформная. Компонентныйсостав БАС каждой из этих фракций был изучен с помощью УВЭЖХ-МС,полная детализация результатов представлена в приложении -2.При этом исследовали спектральные характеристики только тех пиков,которые составляли не менее 1% всей площади пиков на ТАС-хроматограмме(сумма всех длин волн диодно-матричного детектора от 200 до 500 нм).

Напервом этапе изучения полученных спектров проведено обнаружениеполифенольных кислот. Так, только в водной фракции (№1) установленоналичие хлорогеновой кислоты (пик с временем удерживания 3,61 мин). Приэтом во фракциях 1 – 3 наблюдаются спектры веществ с такой же массой, но сдругим временем удерживания (3,72 и 3,99 мин).Можно предположить, что они являются изомерами хлорогеновойкислоты, например, по месту образования эфирной связи caffeic acid с quinicacid (рис. 3.19):Кроме этого, в спектре фракции №1 присутствуют шесть продуктовприсоединения 2х остатков caffeic acid к quinic acid в виде пиков с временамиудерживания 5,5; 8,95; 9,31; 9,44; 9.61 и 10,59 мин.

Хотя в справочной75литературе встречается только 1,5-Dicaffeoylquinic acid (Cynarin), но очевидно,что остальные 5 компонентов являются изомерами цинарина и не только поместу присоединения.N411:28:13 27-Jul-2017MR-RUDN-270717-1AU2: Diode Array328Range: 2.048e-116.832.0e-1N41.0e-115.318.350.02.505.007.5010.0012.5021.6718.15 18.7313.8514.1815.0017.5020.0022.5025.0027.50MR-RUDN-270717-110016.52%N415.3415.3112.87 13.387.31 8.69 9.852.0417.0423.4920.4423.4419.3120.5023.5323.4221.2524.57 26.8830.001: Scan ES+1634.29e727.68 29.3602.505.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.5025.0027.5030.002: Diode Array328Range: 9.461e-125.0027.5025.0027.5030.002: Diode Array328Range: 1.01525.0027.5025.0027.5030.002: Diode Array328Range: 0.56425.0027.5025.0027.50MR-RUDN-250717-5AU9.615.0e-1N310.608.21 9.323.720.02.505.007.5013.81 15.09 16.7710.0012.5015.0017.5020.0022.50MR-RUDN-250717-59.4810010.6330.001: Scan ES+1631.63e8%N39.343.7512.384.76 5.59 7.3114.6316.47 17.8620.3922.0823.4202.505.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.50MR-RUDN-250717-39.44 10.59AU1.09.31 9.605.0e-13.71 4.73 5.500.02.50N28.9514.605.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.50MR-RUDN-250717-310.63100%9.469.353.762.7302.50N29.014.77 5.5510.82 13.707.625.007.5010.0014.6512.5015.0016.4717.5117.5023.4820.0022.50MR-RUDN-250717-15.4910.71AU2.590.013.549.424.0e-13.613.974.751.63 1.962.508.09 9.29N111.087.305.007.5010.0012.5015.0017.5020.0022.50MR-RUDN-250717-13.75100%2.632.374.02 5.535.484.10 5.609.458.9710.627.3402.505.007.5030.001: Scan ES+1632.59e810.00N113.5811.1313.7011.9115.1312.5015.0030.001: Scan ES+1631.03e817.5020.0022.50Time30.00Рисунок 3.19.

Хроматограммы фракций №№ 1-4. Масс-хроматограммыв режиме регистрации позитивных ионов продукта фрагментации 163m/z иУФ-хроматограммы при длине волны 328 нм76OHOHOHOOHOHOOOOHOOHHOHOOHOHOHOHOOOHOHOOHOHOHOРисунок 3.20. Структурные формулы возможных изомеровхлорогеновой кислоты, присутствующих в сырье из сырья I. viscosa (L.)OHOOHHOOOHOHOOHOHOOРисунок 3.21.

Структура 1,5-Dicaffeoylquinic acid (Cynarin)Во фракции извлечении №3 выявлено наличие вещества, образованноготремя остатками caffeic acid с quinic acid (3,4,5-tricaffeoylquinic acid).В бутанольной и этилацетатной фракциях (№ 2 и 3) присутствуетсвободная кофейная кислота (пик с временем удерживания 4,74 мин).В водной фракции (№1) присутствуют многочисленные вещества,представляющие собой эфиры caffeic acid и altraric acid (или такие изомеры,как например, глюкуроновая кислота). Два пика с временами удерживания4,52 и 4,76 мин и одинаковыми спектрами соответствуют Dicaffeoyl-D-altraricacid.Три пика с временами удерживания 9,59; 10,71 и 11,08 представляютTricaffeoyl-D-altraric acid.Один пик во фракции №1 идентифицирован как 2,3,4,5-Tetracaffeoyl-Daltraric acid.

Эта же фракция имеет пик вещества с временем удерживания 7,30мин и молекулярной массой 622, содержащего остаток caffeic acid. Поиск вбазах данных показал, что таким соединением может быть, например,Crenatoside.77Таким образом, по сумме площадей пиков соединений, отражающейколичественную меру производных кофейной кислоты, лидирует фракция №1,а в хлороформной фракции (№4) эти компоненты отсутствуют. Бутанольнаяфракция (№2) содержит только эти компоненты.Следующимэтапомнашейработыявлялосьидентификацияфлавоноидных соединений в исследуемых фракциях.1.ОпределениеFlavononols(Dihydroflavonols)Флавононолы(Дигидрофлавонолы)Эти соединения имеют характерный УФ-спектр с максимумом вблизи к290 нм и продукты фрагментации в режиме регистрации позитивных ионов допика m/z=153 или 167.Во фракциях № 3 и 4 наблюдается пик вещества с временемудерживания 8,32 мин, соответствующий taxifolin (дигидрокверцетин).

Крометого, в этих фракциях имеется пик соединения с временем удерживания 15,52мин - одного из возможного ацетилированного его производного, например,3-O-Acetyltaxifolin.В хлороформной фракции (№4) наблюдается пик вещества с временемудерживания 14,89 мин, которое может иметь структуру метилированноготаксифолина, например, Padmatin, поскольку его ацилированная формаописана в литературе. Его ацилированное производное наблюдается вофракциях №3 и 4 в виде пика с временем удерживания 21,65 мин и можетиметь структуру 3-O-Acetylpadmatin.Пик на хроматограмме фракции №4 с временем удерживания 18.4 минимеет молекулярный вес 302 и ион фрагмента 167, что позволяетпредположить его структуру как 7-Methylaromadendrin.Таким образом, флавононолы (Дигидрофлавонолы) содержатся вбольшей степени во фракции №4, а в водной и бутанольной фракциях (№ 1 и2) не обнаруживаются.2. Определение Flavonols (Флавонолы), Flavons (Флавоны) и ихгликозидов.78Эти соединения имеют максимум поглощения при 335-375 нм и в случаегликозидов фрагментируются в режиме регистрации позитивных ионов толькодо агликона.Фракция№1содержит3пикафлавоноидов,имеющихпредположительно структуры Linariifolioside, Quercetin 3-glucuronide иLuteolin 7-O-glucuronide с временами удерживания 7,74; 8,09 и 8,29 мин,которые отсутствуют в других фракциях.Во фракции №2 флавоноиды не обнаружены.Ряд пиков присутствуют в обоих фракциях №3 и 4.

Пик с временемудерживания 14,02 мин имеет молекулярную массу 332, что возможносоответствует структуре Quercetagetin 3'-methyl ether.Пиксоединениясвременемудерживания14,16минимеетмолекулярный вес 316, что в соответствии с справочными данными позволяетпредположить структуру 3-Methylquercetin.Пик со временем удерживания 15,12 мин имеет такой же молекулярныйвес 316, но предположительно имеет структуру Nepetin, наличие которогоупоминается в литературе.Пик с временем удерживания 15,39 мин имеет молекулярный вес 346 иможет иметь структуру Tomentin (3,7-Dimethylquercetagetin).Пик с временем удерживания 16,80 мин имеет молекулярный вес 300.Наосновании литературных данных извсех возможных изомеровпредпочтение можно отдать структуре Hispidulin.Пик с временем удерживания 20,66 мин имеет молекулярный вес 316 ипредположительно имеет структуру Rhamnetin.В извлечениях №3 и 4 присутствует пик с временем удерживания 13,81мин, для которого не удалось подобрать возможную структуру.В извлечении№3 присутствуют 4 пика с временами удерживания 8,21;8,52; 9,93 и 10,30 мин, которые отсутствуют в других извлечениях и могутиметь структуры Hyperoside, Quercetagetin 3'-methyl ether 3-glucoside,Isorhamnetin-3-O-glucoside и Quercetagetin 3',4'-dimethyl-3-O-glucoside.79В извлечении№4 присутствуют 3 пика с временами удерживания 18,53;18,73 и 19,11 мин, которые отсутствуют в других извлечениях и могут иметьструктуры3’,3-Dimethylquercetin(былобнаруженранеесогласнолитературным данным), Rhamnazin и Centaureidin.Таким образом, наибольшее количество флавонов и флавоноловсодержится во фракции №3, а во фракции № 2 они не обнаружены.Соединения,3.неотносящиесякфлавоноидамидругимполифенольным компонентамИз данных литературы в сырье I.viscosa содержатся два соединения[123,128]:H2CHH2CHOHOHOHCH3OHHH2COinuviscolideM+H=249OH3CCH3tomentosinM+H=249Рисунок 3.22.

Структура инувисколида и томентозинаОказалось, что только во фракции №4 присутствуют 2 пика ссоответствующими масс- и УФ- спектрами.В фракциях №3 и 4 присутствуют пики с временами удерживания 20,4 и23,43 мин с неустановленными структурами.Кроме этого, в этилацетатной фракции №3 присутствует пик веществасо временем удерживания 6,7 мин, для которого нет оснований дляопределения его структуры.В хлороформной фракции №4 присутствует пик соединения с временемудерживания 16,29 мин, для которого тоже нет оснований для определения егоструктуры.80Таким образом, наибольшее количество неустановленных компонентовсодержится во фракции №4, а в водной и бутанольной фракциях (№ 1 и 2)пики таких веществ не обнаружены.3.4.3 Определение содержания летучих компонентов в траве I.viscosaЭкспериментально установлено, что содержание эфирного масла внескольких опытных образцах травы I.viscosa колеблется от 0,22% до 0,47%.Учитывая данные литературы [112,117,147], а также наличие запаха упроизводящего растения в его зарослях и у сырья I.viscosa, детально былисследован состав летучих компонентов в опытных образцах сырья методомГЖХ.Рисунок 3.23.