Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 14

Смесь охлаждают,фильтруют в мерную колбу 50 мл через бумажный фильтр (синяя лента) идоводят объём 70 % спиртом до метки (Испытуемый раствор).2 мл испытуемого раствора помещают в мерную колбу на 25 мл,прибавляют 3 мл раствора алюминия хлорида 3% спиртового, доводят дометки спиртом 70%, перемешивают и выдерживают в течение 40 минут.Оптическую плотность измеряют при длине волны 410 нм в кювете с88толщиной поглощающего слоя 10 мм. Готовят раствор сравнения: 2 млиспытуемого извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 0,5мл уксусной кислоты разведенной, доводят до метки спиртом 70%,перемешивают и измеряют оптическую плотность. Параллельно измеряютоптическую плотность раствора СО рутина, приготовленного аналогичноиспытуемому раствору извлечения.Содержание суммы флавоноидов в % в пересчете на рутин вычисляютпо формуле:А0 - оптическая плотность раствора СОраствора рутина; ∙ 0 ∙ 50 ∙ 2 ∙ 25 ∙ 100 ∙ 100х=А - оптическая плотность раствора0 ∙ ∙ 2 ∙ 100 ∙ 25 ∙ ∙ (100 − )испытуемого извлечения;m0 - масса СО рутина в г,m - масса навески сырья в г,W- потеря в массе при высушиваниисырья,P – содержание основного вещества в СОрутина.Содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин в траве I.viscosaот 1,9 до 2,2 %, т.е.

среди фенольных соединений доля флавоноидов составляетоколо 30%.Валидация разработанной методики количественного определениясуммы флавоноидов в пересчёте на рутин, в сырье I.viscosa представлена ввиде отчета в приложении 6.Методики, предложенные для количественной оценки качества травыI.viscosa, валидированы и позволяют оценить их положительно по всемпараметрам. Можно сделать заключение, что использование разработанныхметодик для оценки содержания суммы фенольных веществ и флавоноидовдаёт результаты, соответствующие требованиям НД на ЛРС и препараты наего основе.893.7 Обоснование биологической активности БАС I.viscosa in silicoС целью выявления основных БАС целевого фрагмента метаболомаI.viscosa, их возможных потенциальных мишеней и фармакологическойактивности использован веб-сервис PASS [12], результаты которогопредставлены в таблице 3.11.Таблица 3.11- In silico прогноз фармакологической активности БАС,идентифицированных в I.viscosaБАС,идентифицированныеметодом УВЭЖХЦинаринПадматинЛютеолинglucuronideГиспидулинОсновные прогнозируемые свойствасогласно PASS on lineАнтибактериальноеПротивовоспалительноеПротивогрибковоеMembrane integrity agonistАнтиоксидантSkin whitenerПротивовоспалительноеПротивовирусное7-O- HemostaticMembrane integrity agonistFree radical scavengerHistamine release inhibitorCapillary fragility treatmentАнтиоксидантAntiprotozoal (Leishmania)ПротивовирусноеПротивогрибковоеAntihemorrhagicПротивовоспалительноеChlordecone reductase inhibitorMembrane permeability inhibitorMembrane integrity agonistHIF1A expression inhibitorAldehyde oxidase inhibitorAnaphylatoxin receptor antagonistKinase inhibitorAntimutagenicInsulysin inhibitorCholereticHistamine release inhibitorAntiprotozoal (Leishmania)Pa0,6410,6290,5950,9670,9090,7850,6910,5860,9800,9750,9660,8930,8440,8370,7980,7570,7320,7040,6110,9650,9500,9450,9380,9300,9270,9090,9060,7600,7510,7250,705Pi0,0070,0260,0190,0020,0030,0010,0170,0140,0010,0020,0010,0030,0000,0030,0050,0040,0080,0030,0070,0020,0020,0040,0040,0030,0030,0030,0020,0040,0030,0040,00990АнтиоксидантАнтисептикHemostaticHistamine release stimulantПротивовоспалительноеSpasmolyticAntimycobacterialИнувисколидПротивогрибковоеAntiprotozoal (Amoeba)АнтибактериальноеХлорогеновая кислота (3- Мембранопротекторкофеилхинная кислота)АнтиоксидантAntieczematic(противоэкземное)АнтипролиферативноеТоментозинAntiprotozoal (Leishmania)ПротивогрибковоеПроведенныйсоединений,скринингприсутствиебиологическойкоторыхв0,6750,6600,6280,6220,6270,5690,5350,6430,5420,5230,9400,8090,8080,7820,8480,621активностиэкстрактеизсырья0,0040,0060,0040,0070,0270,0170,0150,0140,0070,0140,0040,0030,0170,0040,0040,016указанныхдевясилаподтверждено данными литературы, показал, что они могут быть носителямифармакологических эффектов, присущих средствам из I.viscosa, известным втрадиционной медицине и подтвержденных современными исследованиями[74,75,80,88,99,101,163].91Выводы по главе 31.

На основании исследования содержания фенольных соединенийобоснован выбор в качестве лекарственного растительного сырья– травыI.viscosa собранной до цветения.2. Определены макро- и микро- диагностические признаки травы I.viscosa.На оригинальных изображениях зафиксировано наличие четырех видовтрихом, характерных для микроскопического строения сырья.

Проведеныкачественные реакции на установление основных групп БАС.3. Для определения подлинности сырья I.viscosa и препаратов на основеего БАС разработаны методики ТСХ и УФ-СФМ, изучены и установленынормы числовых показателей на сырье.4.При изучении состава БАС целевого фрагмента I.viscosa методомУВЭЖХ и ТСХ в составе фенольных соединений выявлены галловая,кофейная, хлорогеновая кислоты, а также рутин, таксифолин, цинарин,падматин, непетин, гиспидулин, рамнетин и др. вещества. С помощью ГЖХизучен состав летучих соединений (томентозин (и его изомеры), бетапатчулен, кариофиллен оксид (и его изомеры), геранилацетон, альфакопаен-11-ол, ментафуран, производные жирных кислот.5.

Разработаны методики определения количественного содержания БАСв траве I.viscosa, методом УФ-СФМ - сумма фенольных соединений впересчете на хлорогеновую кислоту при 328 нм и сумма флавоноидов впересчете на рутин при 410 нм, последний показатель приемлем длясквозной стандартизации препаратов из сырья;6. СпомощьюпредположительнойпрограммыPASSфармакологической(insilico)активностивыявленывиды(антимикробная,противовирусная, противовоспалительная, антиоксидантная, репаративнаяи др.) БАС целевого фрагмента метаболома I.viscosa (гиспидулин,инувисколид, падматин, хлорогеновая кислота, цинарин, томентозин),92описанные в научной литературе и доказанные в наших исследованиях, наосновании которых подтверждена целесообразность разработки препаратовна его основе для наружного и местного применения.93ГЛАВА 4.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯЖИДКОГО ЭКСТРАКТА ТРАВЫ INULA VISCOSA И ГЕЛЯ НА ЕГООСНОВЕ4.1. Разработка технологии жидкого экстракта травы I.viscosaВэтномедицинеБлижнегоВостокаиСириилекарственнымрастительным сырьем I.viscosa традиционно являются листья растения. Вкачестве объекта для разработки лекарственного средства выбрана трава,собранная до цветения. Такой новый вид сырья был выбран по целому рядуоснований. Во-первых, предполагается заготовку сырья производить впромышленныхмасштабахсменьшейиспользованиемеханизированнойтрудоемкостью,уборки.Во-вторых,чтотребуетдинамическиехарактеристики частиц измельченного стебля богатого механическимитканями, находящиеся вместе с листьями в экстракторе, могут положительновлиять на интенсивность процесса экстракции целевых БАС.

В-третьих, в ещесочных до цветения растения облиственных стеблях содержатся полезныеБАС, которые теряются при использовании только листьев.Для разработки технологии получения жидкого экстракта из травыI.viscosa были изучены следующие характеристики этого сырья: содержание всырье экстрактивных веществ, извлекаемых различными растворителями;произведен подбор экстрагента и условия экстрагирования; подобранооптимальноесоотношениесырье:экстрагент;установленкоэффициентпоглощения сырьем экстрагента.4.1.1 Технологические характеристики сырья I.viscosaСоздание жидкого экстракта травы I.viscosa предполагает изучениетехнологических характеристик сырья, измельченного до размера частиц,проходящих свозь сито 3 мм. В таблице 4.1 приведены технологическиехарактеристики сырья I.viscosa, необходимые для разработки технологииполучения жидкого экстракта.94Таблица 4.1 – Технологические характеристики измельченной травы I.viscosaдля получения жидкого экстрактаНазвание технологической характеристики сырьяТрава I.viscosa (L.),Насыпной объем до уплотнения, млНасыпной объем после уплотнения (1250), млНасыпная плотность до уплотнения, г/см3Насыпная плотность после уплотнения, г/см3Сыпучесть, сКоэффициент поглощения сырья при экстракции 70% спиртом,мл/г80,0±1,367,5±1,80,35±0,0130,41±0,01813,3±0,41,21±0,04Установленные технологические характеристики измельченной травыI.viscosa необходимы для расчета рабочего объема перколятора, расчетаэкстрагента и др.4.1.2.

Разработка способа получения жидкого экстракта из травы I.viscosa(1:1)На основании проведенных экспериментов в качестве экстрагента дляполучения экстракта жидкого был выбран 70% спирт. Этот растворительобеспечивает извлечение из сырья I.viscosa наибольшее количество БАСцелевого фрагмента метаболома (раздел 3.1.2, таблица 3.2).С целью разработки способа получения жидкого экстракта былоисследовано содержание сухого остатка при различных вариантах экстракции.Экстракт получали согласно следующим способам: дробная мацерация,дробная мацерация по принципу противотока, перколяция, а такжемодифицированная методика, разработанная нами.Для разработки технологии получения жидкого экстракта было изученовлияние на выход целевых БАС методики выделения и соотношениясырье:экстрагент (раздел 3.1.2, таблица 3.3).Опираясь на данные разработки методики количественного определениябылоопределено,чтосамымэффективнымявляетсясоотношениесырье:экстрагент 1:50, которое является технологически неприемлемым.

Приэтом разница между извлечениями при соотношениях сырье:экстрагент 1:10 и951:50 составляет всего 0,05%, что является основанием для выборасоотношения сырье:экстрагент 1:10.Результаты определения содержания сухого остатка в извлечениях взависимости от соотношения массы сырья и объема экстрагента представленыв таблице 4.2.Таблица 4.2 – Результаты определения сухого остатка в извлечениях взависимости от соотношения массы сырья: объема экстрагентаСоотношениесырье:экстрагент (г:мл)Содержание сухого остаткаизвлечениях, %в1:51:81 : 101:1219,224,030,830,7Из таблицы 4.2 следует, что наиболее концентрированный жидкийэкстракт получается при соотношении сырье:экстрагент 1:10. При повышениисоотношения на стадии экстракции этих компонентов до 1 к 12 выход сухогоостатка уже не увеличивается.

Таким образом соотношение сырья иэкстрагента 1:10 на головной стадии технологии получения экстракта жидкогоможно признать оптимальным.Оптимальный размер частиц сырья для получения жидкого экстрактапринят на основе результатов разработки методики количественногоопределения (раздел 3.1.2, таблица 3.4), а также эффективности процессафильтрования.В качестве экстрагента при получении жидкого экстракта выбран 70%спирт, как наиболее полно извлекающий БАС целевого фрагмента метаболомаI.viscosa. Выбор методики экстрагирования для получения жидкого экстрактаоснован на содержании сухого остатка в извлечении (табл.4.3).Таблица 4.3. Оценка содержания сухого остатка в извлечении из травыI.viscosa, полученных разными методамиМетодика получения жидкого экстрактаСодержание сухого остатка, %Дробная мацерация (ремацерация)12,1±0,6Дробная мацерация по принципу противотока16,3±0,2Перколяция20,4±0,5Модифицированная методика30,8±0,396В качестве базовых схем экстрагирования без упаривания извлечений исоотношением сырья и экстрагента 1:1 с учетом коэффициента поглощениябыли апробированы методики дробной мацерации и дробной мацерации попринципу противотока, выход сухого остатка составил 12 % и 16 %соответственно.Длядостиженияэтогопоказателясопоставимогоссодержанием экстрактивных веществ в сырье была предложена модификацияметодики перколяции.Результатыпроведенногоисследованияпозволяютпризнатьцелесообразной для получения жидкого экстракта из травы I.viscosaиспользовать модифицированную методику, которая обеспечивает наивысшее(30%) содержание сухого остатка в готовом продукте.Схемаметодикиполученияжидкогоэкстракта(1:1)I.viscosaпредставлена на рисунке 4.1.Этап 1.