Диссертация (Морфофункциональные изменения в стенках желудка при острой тонкокишечной непроходимости (экспериментальное исследование)), страница 9

Напрепаратах одной серии для каждого звена микроциркуляторного руслапроизводили не менее 30 измерений. В процессе вариационно-статистическойобработкиподсчитывалимикрососудов(x),ошибкусреднеарифметическоезначениесреднеарифметического(mX),диаметракоэффициентвариации (Vx) и среднеквадратическое отклонение ( ).Готовые микропрепараты стенок желудкамы изучали с помощьюмикроскопа Nikon Eclipce E 400 с цифровой камерой на увеличении в 200, 400раз. Такого типа микроскоп вместе с одним из графических редакторов (мыиспользовали Adobe Photoshop CS3 Extended RUS) позволяет преобразоватьполучаемое изображение в цифровой вариант (переноситьизображение намонитор компьютера).Морфометриюструктур слизистой оболочки желудка производили спомощью графического редактора Adobe Photoshop CS3 Extended RUS.

Послезагрузки исследуемого изображения задавали единицы измерения, для этогопереводили пиксели, в которых программа измеряет исследуемые объекты «поумолчанию», в микрометры (количество пикселей в микрометре зависит откачества изображения). Для этого в столбце «анализ» выбирали пункт «задатьшкалу измерений», далее «пользовательский…».Затем,не закрывая окноперевода одних величин в другие, проводили горизонтальную линию наизображении исследуемого материала, нажав и не отпуская левую кнопкумыши (предварительно выбрав «линейку» в столбце «анализ»).

Необходимо53следить, чтобы линия была строго горизонтальная, об этом можно судить понулевым показателям высоты и угла («В:», «У:» на панели «линейки»). Длинаэтой линии не имеет принципиального значения, т.к. программа сама посчитаетколичествопикселейввыбранномколичествемикрометров,занесетполученные данные в окно перевода одних единиц в другие. В нашем случае в200 микрометрах (мкм) 780 пикселей. Далее приступали непосредственно кморфометрии.Выбирали на панели инструментов «лассо», нажав и не отпуская левуюкнопку мыши, обводили сосуды ГМЦР и железы слизистой оболочки.

Далеевыбирали столбец «анализ», пункт «записать измерения». Программа самасчитала большую часть интересуемых нас параметров. Подобным образомможно вычислить высоту поверхностного эпителия слизистой оболочки,толщину эпителиального покрова, собственной мышечной пластинки иподслизистой основы, площадь просвета сосудов и площадь сосудистого руслаи желез слизистой оболочки.В медицинских исследованиях все более значительную роль играют методыабстрактно-логического моделирования процессов и математической обработкиполученных данных.Для выявления особенностей структуры микроциркуляторного русла ижелезистого аппарата слизистой оболочки желудка в норме и экспериментевыполнены следующие методы обработки результатов.Метод основан на применении формулы Симпсона для измерения площадилюбых фигур неправильной формы.

Для определения площади одной фигурыдостаточно однократного применения этого метода. Площадь большого числаслучайно и по-разному расположенных сосудов сети (артериол, капилляров,венул) и желез слизистой оболочки требует большого количества замеров(количество замеров обуславливает степень точности метода). Замеры,производимые на микропрепарате через равные интервалы,заносятся врасчетную таблицу, имеющую несколько граф: крайние (КЗ), нечетные (НЗ),54четные замеры (ЧЗ). Итоговые данные подставляются в формулу СимпсонаhПлощадь = ---- ( Сумма КЗ ) + 4 ( Сумма НЗ ) + 2 (Сумма ЧЗ) .3Результат, полученный в мкм2 , пересчитывается на мм2 или см2 .Линейные величины, такие как толщина структур слизистой оболочки,вычисляли с помощью «линейки». Для этого в столбце «анализ» выбиралипункт «инструмент «линейка»», нажав и не отпуская левую кнопку мыши,проводили горизонтальную линию от крайней правой точки исследуемогообъекта до крайней левой точки.

Необходимо следить, чтобы линия быластрого горизонтальная, об этом можно судить по нулевым показателям высотыи угла («В:», «У:» на панели «линейки»). Каждое измерение записывали. Витоге у нас получилась таблица из записанных результатов измерения. Ксожалению, используемая нами программа не позволяла экспортироватьполученные данные непосредственно в табличный редактор, поэтому сначалакопировалирезультатывтекстовыйредактор«блокнот»,азатемэкспортировали их с редактор таблиц (например «Excel»).2.2.2.3. Гистохимические методики исследования.Качественныегистохимическиеметодыисследованияоснованынаиспользовании реакций, с помощью которых выявляют химические вещества вклетках тканей и органов. Зная, как распределяются в тканях белки, жиры,углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при различных воздействияхна организм, можно судить с большей или меньшей вероятностью онаправленностиСовременныеметаболическихпроцессовгистохимическиеметодывисследуемыхобнаруживаютструктурах.вклеткахаминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, витамины,минеральные и другие вещества, определяют активность различных ферментов,например в цикле Кребса.

Выявление этих веществ основано на специфичности55реакций между химическим реактивом и субстратом, входящим в составклеточных и тканевых структур, и на выделении продуктов химическихреакций в виде окрашенных осадков. Чтобы повысить специфичность реакций,часто применяют метод ферментативного контроля. Так, например, длявыявления ДНК и РНК используют галлоцианин - хромовые квасцы,окрашивающие нуклеиновые кислоты в стойкий сине-фиолетовый цвет.Применение гистохимических методик в нашем исследовании продиктованонеобходимостью изучения состояния обменных процессов в клетках эпителия ижелез слизистой оболочки желудка после моделирования разных видовкишечной непроходимости в различные сроки.

Для оценки уровня метаболизмапроизводили определение содержания суммарных нуклеиновых кислот пометоду Эйнарсона – реакции с галлоцианин - хромовыми квасцами. Помимоинформации о нуклеопротеидном обмене в клетке, реакция с галлоцианинхромовыми квасцами давала возможность оценить морфологические измененияв клеточном составе желез слизистой оболочки. Окраску проводили напарафиновых срезах после фиксации материала в жидкости Карнуа.Результаты реакций оценивали количественно с помощью количественнойцитоспектрофотометри и компьютерных программ, позволяющих оценитьколичество единиц площади объекта исследования, занятых продуктамицитохимической реакции.2.2.2.4.

Количественная оценка результатов цитохимических реакций.Цитоспектрофотометрия - это метод количественного и качественногоизучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельных клеток. Сего помощью можно установить суммарное содержание белков или другихэлементов. В основе метода лежит принцип абсорбции спектрофотометрии.Например, с помощью интерферометрии можно оценить сухую массуиконцентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.Количественную оценку результатов цитохимических реакций в нашем56исследовании проводили посредством точечной фотометрии клеток железслизистой оболочки. Выбор точек измерения основывался на статистическихтребованияхдостовернойдостаточностиданныхсцельюоценитьгистохимические изменения в стенках желудка.

Измерение выполняли нафотомикроскопе Оптон-III с приставкой ФМЭЛ-1 и цифропечатью приувеличении 40 х 3 х 1,25. Раздельно определяли фоновый фототок (ФФ) ифототок от объекта (Фо), а также "темновой" фототок - ошибка прибора (Фт).Дальнейшее определение активности нуклеопротеидного обмена производилипо формуле закона Бугера-Ламберта-Бера. Содержание нуклеопротеидовпропорциональны количеству продуктов цитохимической реакции (С).Чем больше продукта реакции, тем больше поглощение исходного потокасвета, излучаемого источником (фоновый фототок), тем меньше значениефототока от объекта. По закону Бугера-Бера :I = I0 x 10- bCxили Ф0 =Фф х 10-bСхгде b - коэффициент пропорциональности, не зависящий от C,x - толщина среза,Ф0Ф0-bСхотсюда -------- = 10→ lg ------- = -bСх;ФфФфФ0bСх = -lg------ФфФ0 - Фтс учетом ошибки прибора bСх = -lg ----------Фф - ФтПолагая, что коэффициент b одинаков для всех срезов, содержащих группыцитохимических реакций, и толщина срезов "х" одинакова для всех срезов,можно считать, что произведениеbСхявляется пропорциональным57количеству вещества и может служить его характеристикой.

Необходимоотметить, что толщина срезов существенно не влияет на погрешностьизмерения активности нуклеопротеидного обмена, так как с изменением "х"изменяется и "С" - количество продуктов реакции, а соответственно и фототоки(правая часть уравнения).Ф0 - ФтТаким образом, A = -lg --------------- в единицах оптической плотности.Фф - ФтУчитывая высокую специфичность реакций между химическим реактивом иисследуемым субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур,выделение продуктов цитохимических реакций в виде окрашенных осадков,также высоко специфично.Исходя из этого, мы полагаем достоверным для количественной оценкисодержания продуктов реакции в объектах исследования, использованиеоригинальной методики, включающей в себя компьютерные программы,позволяющие оценить количество единиц площади объекта исследования,занятых продуктами цитохимической реакции.Так же необходимо отметить, что количество единиц площади объектаисследования, занятых продуктами цитохимической реакции - это доляпигментов, являющихся результатом цитохимической реакции, в изначальномчистом цвете, после преобразования в черно-белые тона различной степенинасыщенности.Поскольку доля пигментов в единице площади исследуемых объектовхарактеризует количество продуктов цитохимической реакции в этой жеплощади, очевидно, что площадь, занимаемая продуктом цитохимическойреакции на площади гистологического среза в объектах исследования,пропорциональнаколичествусубстрата,вступившеговреакцию,т.е.характеризует количество химического вещества в клетках тканей и органов, а58так же – в структурных компонентах клеток этих тканей и органов.

Такимобразом,измеривплощадьконкретногоцветовогодиапазона,соответствующего цветовому диапазону примененного гистохимическогомаркера, можно получить относительную количественную характеристикухимического субстрата, а, проследив эти изменения в динамике развитияпроцессов в тканях и органах, достоверно определить направленность этихизменений.Для измерения площади можнопрограмму,позволяющуюприменять любую морфометрическуюпроводитьсегментациюобъекта.Внашемисследовании использовалась программа «Image-Pro Plus». Фотосъемкапрепаратов производилась на микроскопе «Axioplan 2 Imaging», оснащенномцифровой камерой «AxioCam HRc» с разрешением 2776х2080пк.

приувеличении 50, 200, 400. На первом этапе изображение в программе «AdobePhotoshop»преобразовывалось в черно-белый режим. Затем, была созданарамка – квадрат со сторонами 55х55 мкм, которую можно переноситьлюбую фотографию. С помощью этой рамкинана срезе в ручном режимевыделялись интересующие области. На следующем этапе в программе «ImageProPlus»спомощьюфункцииCount/Sizeпроизводитсявыделениесоответствующего цветового диапазона и подсчитывается количество пикселейданного цвета на заданной площади. Зная площадь измеренной области(55х55мкм), можно, вычислив площадь одного пикселя, получить площадьокрашенного субстрата в мкм2.Данный метод морфометрии продуктов цитохимических реакций позволяетвыполнять исследование не только для определенных клеточных структур, но идля тканевых образований, например для сравнения уровня обменныхпроцессов в единице площади эпителия, мышечной оболочки органа и т.п.Выбор точек измерения основывается на статистических требованияхдостоверной достаточности данных с целью оценить гистохимическиеизменения в исследуемых органах и тканях.59Результаты измерений обрабатывали статистически при помощи методовлинейной статистики и с применением корреляционного и нелинейногорегрессивного анализа.