Диссертация (Изучение фармакологических свойств Caragana Jubata), страница 7

Полученный отвар охлаждали при комнатной температуре в течение 10мин, процеживали и отфильтровывали. Полученное водное извлечение упаривали до содержания влаги 40% на роторном испарителе BUCHI (Германия)при следующих условиях: разрежение (72 ± 2) мбар, температура холодиль-36  ника (+10 ± 2) °С. Из полученной вытяжки готовили лиофилизат, что обеспечивало точность дозирования. Для этого полученную вытяжку замораживалипри температуре (–24,0 ± 1,0) °С. Процесс высушивания проводили в сублимационной сушилке Heto Dry Winner (Дания) при остаточном давлении (0,1 ±0,03) мбар и комнатной температуре в течение 22–24 ч (влажность 5%). Вводном извлечении также был определен выход сухого остатка, который составил 18,2% (рассчитано по формуле из ОФС.1.5.3.0006.15 «Определениесодержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье илекарственных растительных препаратах», ГФ XIII):, где(1)X – содержание экстрактивных веществ, %; m – масса сухого остатка, г; a –навеска лекарственного растительного сырья, г; V – объем экстрагента, используемого при однократной обработке лекарственного растительного сырья, мл; W– влажность лекарственного растительного сырья, %.Полученное лиофилизированное водное извлечение караганы гривастой (ЛВИК) использовалось в исследовании фармакологической активностиC.

jubata в экспериментальной дозе 51,4 мг/кг в пересчете на сухой остаток,определенной согласно литературным данным по применению сырья в этномедицине [Телятьев В.В., 1976]. С учетом коэфицента межвидового переноса[Хабриев Р.У., 2005] были определены дозировки для крыс и мышей, доза накрысу составляла 308,4 мг/кг, на мышь – 626 мг/кг.37  2.2.

Методы исследования химического состава (полифенольныхсоединений) и антиоксидантной активности лиофилизированноговодного извлечения караганы гривастой2.2.1. Анализ флавоноидов методом ВЭЖХ с диодно-матричнымспектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированиемИсследования проводились с использованием системы ВЭЖХ Agilent1100 (Agilent Technologies, США), оснащенной бинарным насосом, дегазатором, термостатируемым автосамплером, термостатом колонок, диодноматричным спектрофотометрическим детектором (ДМД) (Agilent 1100 SeriesDiode Array) и времяпролетным масс-спектрометрическим (МС) детектором(Agilent 6200 TOF LC/MS).

Идентификацию и определение содержания флавоноидов проводили по оригинальной, ранее разработанной Перовой И.Б методике для анализа флавоноидов в плодах черники обыкновенной, арониичерноплодной, смородины черной и калины обыкновенной [Перова И. Б.,2014].Условия хроматографииНеподвижная фаза: колонка ProteCol C18 HPH125 250×4,6 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: А – 0,1% раствор муравьиной кислоты,В – ацетонитрил.

Градиентное элюирование 0–5 мин, 15–20% В, 5–20 мин,20–40% В, 20–30 мин, 30–40 мин, 40–60% В, затем регенерация колонки 41–50 мин, 15% В. Температура колонки 30 ºС, скорость подачи элюента 0,5мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл. Диодно-матричное детектированиепроводилось при 3 аналитических длинах волн: 339, 350 и 365 нм.Условия масс-детектированияИонизация электроспреем, сканирование масс – в режиме регистрации положительных ионов (ESI-MS+) в диапазоне m/z 200–1000 Да. Рабочие параметры источника ионизации: напряжение на капилляре 3500 В, поток газаосушителя (азот) 9 л/мин, температура 325 ºС, давление на распылителе 0,27МПа.

Напряжение на фрагменторе 175 В, на конусе – 65 В, на октополе OCT38  1RF Vpp – 250 В. Обработка данных осуществлялась с помощью программного обеспечения Agilent MassHunter Workstation Software. Идентификацияфлавоноидов основывалась на совпадении времен удерживания УФ- и массспектров индивидуальных соединений с имеющимися стандартами и литературными данными. Количественное определение флавоноидов проводилосьметодом внешнего стандарта. Содержание гликозидов кемпферола в водныхизвлечениях караганы (сборы 2010 и 2015 гг.) рассчитывали по стандартукемпферол-3-глюкозида.

Дигликозиды кверцетина и изорамнетина рассчитывали по стандарту рутина, 3-галактозиды и 3-глюкозиды мирицетина, кверцетина и изорамнетина – по стандартам гиперозида и изокверцитрина соответственно. Количество 3-рамнозидов мирицетина, кверцетина, изорамнетина, ларицитрина и сирингетина оценивалось с использованием стандартаизокверцитрина, а пентозидов (в т.ч. арабинозидов и ксилозидов) этих флавонолов – с использованием стандарта авикулярина.Содержание каждого индивидуального флавоноида в исследуемых образцах в мг/г рассчитывали методом внешнего стандарта по формуле:хСх, где(2)Схi – содержание индивидуального флавоноида в водном извлечении, мг/г;Sx – площадь пика флавоноида в водном извлечении; Sst – площадь пикавнешнего стандарта; Сst – концентрация внешнего стандарта, мг/мл; K – содержание флавоноида в стандартном образце в %, деленное на 100; Vх – объем разведения лиофилизированного водного извлечения, мл; mx – массанавески лиофилизированного водного извлечения, мг; 1000 – коэффициентпересчета на 1 г.Суммарное содержание флавоноидов в водных извлечениях караганы(2010 и 2015 гг.) рассчитывали по формуле:∑ флав.∑(3)39  МетрологическиехарактеристикиметодикиоценивалисогласноОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента»ГФ III изд.Подготовка пробОколо 0,5 г (точная навеска) лиофилизированных извлечений караганыгривастой (сборы 2010 и 2015 гг.) раздельно помещали в мерные колбы на25 мл, добавляли 20 мл 60% водного метанола.

Экстракцию проводили наультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 25 мин. Далее образцы доводили до метки 60% водным метанолом. Аликвоту образцов помещали в центрифужную пробирку вместимостью 1,5 мл и центрифугировали втечение 5 мин при 15000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в виалу вместимостью 0,5 мл и помещали в автосемплер.Стандарты и растворителиВ качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества: рутин (≥94%, Sigma, США), гиперозид(≥95%, HWI ANALYTIK GmbH, Германия), изокверцитрин (≥94%, HWIANALYTIK GmbH, Германия), авикулярин (ChromaDex, США), кемпферол3-глюкозид (≥95%, PhytoLab, Германия), витексин (≥96%, Fluka, Швейцария),изовитексин (≥99%, Extrasynthese, Франция), лютеолин-7-глюкозид (≥98%,Extrasynthese, Франция), мирицетин (~85%, Sigma), кверцетин (≥98%, Sigma,США), кемпферол (≥99%, Extrasynthese, Франция), изорамнетин (≥99%,Fluka, Швейцария), лютеолин (≥99%, Extrasynthese, Франция), апигенин(≥95%, Sigma, США).

При проведении исследований были использованыследующие растворители и реактивы: вода очищенная (получена с помощьюсистемы MilliQ® Advantage A10), ацетонитрил UPLC/HPLC grade производства AppliChem PanReac (Дармштадт, Германия), метанол UPLC/HPLC gradeпроизводства J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Пало-Альто, США),40  муравьиная кислота 98–100% производства Merck (Дармштадт, Германия),натрия хлорид («Обновление», Россия).2.2.2. Исследование антиоксидантной активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойметодом активированной хемилюминесценции АБАП in vitroДля приготовления водных извлечений к навеске сырья добавляли дистиллированную воду (из расчета 1 мг/мл), полученный образец перемешивали и инкубировали в течение 30 мин на кипящей водяной бане. Далее пробы охлаждали, восстанавливали общий объем дистиллированной водой и использовали для дальнейших исследований.

Антиоксидантную активностьраздельно приготовленных образцов водных извлечений (сборы 2010 и2015 гг.) определяли по торможению ими окисления люминола, которое индуцировали водорастворимыми пероксильными радикалами, образующимисяпри термическом разложении 2,2’-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида(АБАП) [Чехани Н.Р., Теселкин Ю.О., 2012]. Реакционная среда имела следующий состав: 50 мкМ люминола (чда, «Вектон», Россия), 200 мкМ ЭДТА(≥99%, Sigma-Aldrich) и 1 мМ АБАП (Aldrich, США) в 0,1 М Трис-HCl буфере, содержащем 0,1 М хлорида калия (Merck, Германия) pH 8,0.

Процессокисления люминола сопровождался развитием хемилюминесценции (ХЛ),интенсивность которой достигала стационарного уровня через 10 мин последобавления АБАП. Для оценки АОА водных извлечений их добавляли в реакционную среду после достижения стационарного уровня кинетики ХЛ ирегистрировали латентный период свечения. В качестве антиоксиданта сравнения использовали тролокс. АОА исследуемых образцов выражали в видеколичества ммоль тролокса (Sigma, США) на 1 г сухого вещества сырья(«тролоксовый эквивалент» АОА).

Измерение ХЛ люминола проводили нахемилюминометре Lum-1200 (ООО «ДиСофт», Россия) с программным обес-41  печением PowerGraph 3,3 Professional при постоянном перемешивании и температуре 37 оС.2.3. Лабораторные животныеИсследования фармакологической активности лиофилизированноговодного извлечения были проведены на белых беспородных мышах-самцахмассой 20–25 г и на белых крысах-самцах линии Wistar массой 200–220 г,полученных из питомника лабораторных животных «КролИнфо» (Московская область, Орехово-Зуевский район).Эксперименты на животных проводились с соблюдением правовых иэтических норм обращения с животными в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (European Conventionfor the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes.

Strasbourg, 1986), с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 33044-2014) и с ПриказомМЗ и СР РФ № 199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил лабораторнойпрактики».Длительность акклиматизационного периода для всех животных составила 14 дней. Экспериментальные животные содержались в условиях вивария при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму (ГОСТ Р 9.804-2006 и РД-АПК 3.10.07.02.-14) в индивидуальных пронумерованных клетках.2.4.

Методы статистической обработки результатовРезультаты исследования обработаны методами вариационной параметрической статистики с использованием t-критерия Стьюдента при нор-42  мальном распределении и представлены как средняя величина ± стандартнаяошибка среднего (М ± m) при помощи пакета статистических программ Statistica 10. Различия считались статистически достоверными при уровне отличия p ≤ 0,05. Обозначения в таблицах:* – достоверное отличие от интактной группы, p ≤ 0,05;** – достоверное отличие от контрольной группы, p ≤ 0,05;# – достоверное отличие от группы сравнения, p ≤ 0,05.2.5.