Диссертация (Изучение фармакологических свойств Caragana Jubata), страница 8

Методы токсикологического исследованиялиофилизированного водного извлечения караганы гривастой2.5.1. Определение острой токсичностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойИсследование острой токсичности водного извлечения караганы гривастой провели на 54 беспородных белых мышах-самцах массой 20–25 г согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) и ГОСТу 32644-2014 «Методы испытания повоздействию химической продукции на организм человека.

Острая пероральная токсичность – метод определения класса острой токсичности (OECD,Test № 423:2001, IDT)» (2015 г.). При оценке острой токсичности растворЛВИК испытывали в дозах 626 (экспериментальная терапевтическая доза),1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 и 7000 мг/кг (максимальная техническивозможная доза для введения) (табл. 2).

Раствор, который однократно вводился мышам перорально при помощи атравматичного зонда, представлял собой субстанцию темно-коричневого цвета с ароматным запахом. Контрольная группа животных получала изотонический раствор хлорида натрия.Общая продолжительность наблюдения за животными составила 14 суток. Впервые сутки животные находились под непрерывным наблюдением. За весь43  период наблюдения регистрировались признаки интоксикации, сроки развития интоксикации и гибели животных. Также оценивалось общее состояниеживотных, двигательная активность, суточное потребление воды и пищи иконсистенция каловых мас.

На 15-е сутки эксперимента под легким эфирнымнаркозом осуществляли эвтаназию животных и проводили макроскопическоеисследование внутренних органов.Таблица 2Схема исследования острой токсичности лиофилизированного водногоизвлечения караганы гривастойВид и полживотныхМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыКоличествоживотных вгруппе66666666Тестируемое веществолиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганылиофилизированное водное извлечение караганыДоза,Способ введениямг/кг626внутрижелудочно1000 внутрижелудочно2000 внутрижелудочно3000 внутрижелудочно4000 внутрижелудочно5000 внутрижелудочно6000 внутрижелудочно7000 внутрижелудочно2.5.2.

Определение острой накожной токсичностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойИсследование острой накожной токсичности лиофилизированного водного извлечения караганы гривастой провели на 54 беспородных белых мышах-самцах массой 20–25 г согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) и ГОСТ 32373-2013«Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм...44  испытаний по оценке острой токсичности при накожном поступлении»(OECD, Test № 423:2001, IDT)» (2015 г.). Всем животным накожно однократно в первые сутки наносили аппликации раствора лиофилизата караганы гривастой в указанных дозах: 626, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 и 7000мг/кг (табл. 3).

Перед нанесением препаратов у мышей в области спины выбривали участок площадью 2,5 см2. Общая продолжительность наблюденияза животными составила 14 суток. В первые сутки животные находились поднепрерывным наблюдением. За весь период наблюдения регистрировалипризнаки интоксикации, сроки развития интоксикации и гибели животных.Также оценивалось общее состояние животных, двигательная активность, суточное потребление воды и пищи и консистенция каловых мас. На 15-е суткиэксперимента под легким эфирным наркозом осуществляли эвтаназию животных и проводили макроскопическое исследование внутренних органов.Таблица 3Схема исследования острой накожной токсичности лиофилизированноговодного извлечения караганы гривастой при накожном примененииВид и полживотныхМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыМышисамцыКоличествоживотных вгруппе66666666Тестируемое веществолиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганылиофилизированноеизвлечение караганыДоза,мг/кгСпособвведенияводное626накожноводное1000накожноводное2000накожноводное3000накожноводное4000накожноводное5000накожноводное6000накожноводное7000накожно45  2.6.

Методы исследования дерматотропной активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастой2.6.1. Исследование противовоспалительной активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастой принакожном применении на модели контактного дерматитаИсследования противовоспалительной активности полученного лиофилизированного водного извлечения караганы гривастой проведены с использованием модели контактного дерматита согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.).Эксперименты осуществляли на 40 аутбредных белых крысах-самцахмассой 200–220 г.

После завершения 14-дневного карантина все животныебыли случайным образом разделены на следующие группы по 10 животных вгруппе (табл. 4):Таблица 4Группы исследуемых животных№группы1234НазваниегруппыИнтактнаяn=10Контрольнаяn=10Опытнаяn=10Сравненияn=10Описание группыУ крыс не вызывали контактный дерматит и не наносили исследуемые препаратыКрысам с контактным дерматитом наносили аппликации дистиллированной водойКрысам с контактным дерматитом наносили аппликации ЛВИК в виде раствора для местного примененияКрысам с контактным дерматитом наносили аппликации крема «Акридерм» (бетаметазон) (АО «Акрихин», Россия).Для индукции контактного дерматита использовали стандартный аллерген – 2,4-динитрохлорбензол (2,4-ДНХБ) (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 5% в смеси этилового спирта 95% и ацетона осч (2:1).46  В течение первых 4 суток с момента начала исследования всем животным на предварительно выбритый участок спины площадью 3,5 см2 2 раза всутки микропипеткой наносили 0,125 мл 5%-ного раствора 2,4-ДНХБ.

Критерием развития патологического процесса служило появление на 5-е суткиотека и выраженной эритемы на исследуемом участке кожи с последующимобразованием плотной, прилегающей к коже геморрагической корки.Начиная с 5-х суток эксперимента, крысам опытной группы и группысравнения в течение 8 суток на область с модельным контактным дерматитомнаносили водный раствор ЛВИК и препарат сравнения «Акридерм» (бетаметазон) 1 раз в сутки.Лиофилизат водного извлечения караганы применяли согласно литературным данным об использовании растения в традиционной медицине – вдозе 10 мг в виде 10%-ного раствора, что соответствует отвару, приготовленному в соотношении 1:10 [Телятьев В.В., 1976]. Свежеприготовленный раствор наносили на пораженный участок кожи микропипеткой в объеме 500мкл. Животные группы сравнения получали аппликации крема «Акридерм» вдозе, рекомендованной производителем – 1 г.

Контрольные животные получали аналогичные по объему и месту нанесения аппликации дистиллированной водой. Продолжительность исследования составляла 12 суток: 4 из них –аппликация 2,4-ДНХБ и 8 – нанесение исследуемых препаратов. На 13-е сутки всех животных выводили из эксперимента с последующим взятием образцов кожного лоскута для гистологических исследований и измерения активности воспалительного фермента миелопероксидазы (МПО).В ходе эксперимента для оценки эффективности ускорения восстановительных процессов после индукции контактного дерматита были использованы следующие данные: балльная оценка проявления контактного дерматита; толщина кожной складки в очаге КД в мм; гематологические показатели крови подопытных крыс.Указанные параметры фиксировали трижды в ходе эксперимента:47  после 4 суток нанесения 2,4-ДНХБ до начала лечения;после 3 суток лечения КД;после 8 суток лечения КД.Балльную оценку проявления контактного дерматита проводили поспециальной шкале кожных проб [Смирнов В.С, Саватеева-Любимова Т.Н.,2013]:0 – отсутствие реакции;0,5 – появление локальных очагов гиперемии;1 – выраженная гиперемия;2 – гиперемия и отечность;3 – резкое покраснение и отек;4 – образование эрозий;5 – образование геморрагической корки.Оценка противовоспалительной активностиУ всех экспериментальных животных с помощью микрометра МК-25(ЗАО «Крин», Россия) измеряли толщину кожной складки в зоне с контактным дерматитом.По результатам измерений в конце эксперимента рассчитывали индексингибирования воспалительной реакции по формуле [Ершик В.

М., ГолубцовВ. В., 2012]:ИИвр100%, где(4)d0 – толщина кожной складки до начала лечения, мм,d – толщина кожной складки после лечения, мм.Таким образом, эффективность ингибирования воспалительной реакции оценивали по разнице в толщине кожной складки до и после лечения впроцентах. Чем больше показатель ИИ, тем более выражено противовоспалительное действие применяемого препарата.48  Измерение гематологических показателейОбразцы крови крыс для гематологических исследований отбиралисьиз хвостовой вены в объеме 250 мкл в пробирки ЭДТА–К3 (Apexlab, Россия).Затем кровь анализировали на гематологическом анализаторе BC-3200 vet(Myndray, Китай).Гистологические исследованияМатериал помещали в 10%-ный забуференный формалин и далее обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей, предварительно поместив материал «на ребро» для получения в дальнейшем срезов всей толщикожного лоскута, и заливали в парафин.