Диссертация (Изучение фармакологических свойств Caragana Jubata), страница 9

Парафиновые блоки нарезали на роторном микротоме на серийные срезы толщиной 4 мкм, затем фиксировалиих на предметные стекла, покрытые полилизиновым адгезивом (MainzelGlaser, Германия), и инкубировали при 37 °С в термостате в течение 12 ч.Полученные препараты депарафинировали, регидратировали, окрашивалигематоксилином и эозином и заключали под покровные стекла с использованием монтирующей среды Shandon Mount.Степень заживления кожи при контактном дерматите оценивали последующим морфологическим признакам: наличие/отсутствие эрозии инекроза, наличие грануляционной ткани и ее зрелость, эпителизация, характер воспалительного инфильтрата (лейкоцитарная, лимфоидная, макрофагальная).Измерение активности миелопероксидазыДля измерения пероксидазной активности кожный лоскут иссекали вобласти очага контактного дерматита и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера в 0,15 М растворе хлорида натрия.

После центрифугирования полученных гомогенатов в течение 20 мин при 3000 об/мин отделяли супернатанты и оценивали в них содержание белка методом Лоури [LowryO.H., 1951] и пероксидазную активность по окислению о-дианизидина [Ми-49  хальчик Е. В., Титкова С. М., 2006; Sun G., Zhang. Y., 2007].

Используя молярный коэффициент экстинкции Ɛ560=20040 М-1 см-1, рассчитывали количество окисленного о-дианизидина, образовавшегося в течение первых 5 минреакции, и результат представляли, принимая величину, равную 1 мкмоль/5мин, за 1 единицу (ед). Активность МПО выражали в пересчете на белок всупернатанте гомогената (ед/г).2.6.2.

Исследование противовоспалительной активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойпри пероральном применении на модели контактного дерматитаЭксперименты осуществляли на 30 аутбредных белых крысах-самцахмассой 200–220 г. После завершения 14-дневного карантина все животныебыли случайным образом разделены на следующие группы по 10 животных вгруппе (табл. 5).Таблица 5Группы исследуемых животных№группы123НазваниегруппыИнтактнаяn=10Контрольнаяn=10Опытнаяn=10Описание группыУ крыс не вызывали контактный дерматит и не вводили им исследуемые препаратыКрысам с контактным дерматитом внутрижелудочновводили дистиллированную водуКрысам с контактным дерматитом внутрижелудочновводили раствор ЛВИК, разведенного дистиллированной водой.В течение первых 4 суток с момента начала исследования всем животным, кроме интактных, на предварительно выбритый участок спины площадью 3,5 см2 2 раза в сутки микропипеткой наносили 0,125 мл 5%-ного раствора 2,4-ДНХБ.

Критерием развития патологического процесса служило появление у животных на 5-е сутки отека и выраженной эритемы на исследуе-50  мом участке с последующим образованием плотной, прилегающей к кожегеморрагической корки.Начиная с 5-х суток эксперимента, крысам опытной группы и группысравнения в течение 8 суток внутрижелудочно 1 раз в сутки вводили растворЛВИК в дозе 308 мг/кг в пересчете на сухой остаток. Свежеприготовленныйраствор вводили через атравматичный желудочный зонд в объеме 1,5 мл.Контрольные животные получали эквиобъемные порции дистиллированнойводы.Продолжительность исследования составляла 12 суток: 4 из них – аппликация 2,4-ДНХБ и 8 – введение препаратов.

На 13-е сутки всех животныхвыводили из эксперимента с последующим взятием образцов кожного лоскута для гистологических исследований и измерения активности воспалительного фермента миелопероксидазы (МПО).В ходе эксперимента для оценки эффективности ускорения восстановительных процессов после индукции контактного дерматита были использованы следующие данные: балльная оценка проявления контактного дерматита; толщина кожной складки в очаге КД в мм; гематологические показатели крови подопытных крыс.Указанные параметры фиксировали трижды в ходе эксперимента:после 4 суток нанесения 2,4-ДНХБ до начала лечения;после 3 суток лечения КД;после 8 суток лечения КД.Балльную оценку проявления контактного дерматита проводили поспециальной шкале кожных проб:0 – отсутствие реакции;0,5 – появление локальных очагов гиперемии;1 – выраженная гиперемия;2 – гиперемия и отечность;51  3 – резкое покраснение и отек;4 – образование эрозий;5 – образование геморрагической корки.Оценка противовоспалительной активностиУ всех экспериментальных животных с помощью микрометра МК-25(ЗАО «Крин», Россия) измеряли толщину кожной складки пораженногоучастка.По результатам измерений в конце эксперимента рассчитывали такжеиндекс ингибирования воспалительной реакции по формуле:ИИвр100%, где(5)d0 – толщина кожной складки до начала лечения, мм,d – толщина кожной складки после лечения, мм.Измерение гематологических показателейОбразцы крови крыс для гематологических исследований отбиралисьиз хвостовой вены в объеме 250 мкл в пробирки ЭДТА-К3 (Apexlab, Россия).Затем кровь анализировали на гематологическом анализаторе BC-3200 vet(Myndrey, Китай).Гистологические исследованияМатериал помещали в 10%-ный забуференный формалин и далее обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей, предварительно поместив материал «на ребро» для получения в дальнейшем срезов всей толщикожного лоскута, и заливали в парафин.

Парафиновые блоки нарезали на роторном микротоме на серийные срезы толщиной 4 мкм, затем фиксировалиих на предметные стекла, покрытые полилизиновым адгезивом (MainzelGlaser, Германия), и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 12 ч. По-52  лученные препараты депарафинировали, регидратировали, окрашивали гематоксилином и эозином и заключали под покровные стекла с использованием монтирующей среды Shandon Mount.Измерение активности миелопероксидазыДля измерения пероксидазной активности кожный лоскут иссекали вобласти раны и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера в 0,15 Мрастворе хлорида натрия.

После центрифугирования полученных гомогенатов в течение 20 мин при 3000 об/мин отделяли супернатанты и оценивали вних содержание белка методом Лоури [Lowry O.H., 1951] и пероксидазнуюактивность по окислению о-дианизидина [Михальчик Е. В., Титкова С. М.,2006; Sun G., Zhang. Y., 2007]. Используя молярный коэффициент экстинкции Ɛ560=20040 М-1 см-1, рассчитывали количество окисленного одианизидина, образовавшегося в течение первых 5 мин реакции, и результатпредставляли, принимая величину, равную 1 мкмоль/5 мин, за 1 единицу(ед). Активность МПО выражали в пересчете на белок в супернатанте гомогената (ед/г).2.6.3. Исследование ранозаживляющей активностилиофилизированного водного извлечениякараганы гривастой на модели линейной раныИсследования ранозаживляющей активности полученного лиофилизатаводного извлечения караганы проведены с использованием модели линейнойраны согласно «Руководству по проведению доклинических исследованийлекарственных средств» (2012 г.).Эксперименты осуществляли на 40 аутбредных белых крысах-самцахмассой 200–220 г.

После завершения 14-дневного карантина все животныебыли случайным образом разделены на группы (табл. 6).53  Таблица 6Группы исследуемых животных№группы1234НазваниегруппыИнтактнаяn=10Контрольнаяn=10Опытнаяn=10Сравненияn=10Описание группыКрысы не подвергались хирургическому вмешательству, и им не наносили исследуемые препаратыКрысам с линейной раной наносили аппликации дистиллированной водойКрысам с линейной раной наносили аппликацииЛВИК в виде раствора для местного примененияКрысам с линейной раной наносили аппликации метилурациловой мазью (ОАО «Нижфарм», Россия)В первый день эксперимента всем животным, кроме интактных, напредварительно выбритый участок спины по специальному трафарету одноразовым скальпелем наносилась линейная рана длиной 3 см и глубиной дособственной фасции.  Рана представляла собой продольный разрез кожи иподкожной жировой клетчатки по средней линии спины.

После выполненияразреза края раны сближали, накладывая 2 шва на равном расстоянии друг отдруга, что обеспечивало регенерацию раны от краев к центру.Все оперативные вмешательства на животных осуществлялись поднаркозом. В качестве анестезирующего вещества использовали разрешенныйна территории РФ диссоциативный анестетик «Золетил 100» (тилетамин гидрохлорид + золазепам гидрохлорид) (Virbac, Франция) в комбинации с «Рометаром» (ксилазин) (Bioveta, Чешская республика).Лиофилизат водного извлечения караганы применяли согласно литературным данным об использовании растения в этномедицине – в дозе 10 мг ввиде 10%-ного раствора, что соответствует отвару, приготовленному в соотношении 1:10 [Телятьев В.В., 1976]. Свежеприготовленный раствор наносилина пораженный участок кожи микропипеткой в объеме 500 мкл.  Животныегруппы сравнения получали аппликации метилурациловой мази в дозе, рекомендованной производителем, – 1 г.