Диссертация (Фармакокинетика, безопасность и переносимость нового лекарственного средства ФС-1), страница 8

Затем проводились контрольные визиты соценкойобщегосостояния,мониторингомпоказателейлабораторныхиинструментальных исследований. Порядок обследования представлен в таблице 2.Таблица 2График обследования добровольцев в ходе исследования однократногоприема ФС-1ПериодПериод последующегонахождения в КБнаблюденияВид обследованияПрием ЛСДо приема-1деньДни после приема ЛС22345678910Оценка общего состояния+++++++++Выявление побочных эффектов-++++++++Жалобы, анамнез+++++++++Физикальное обследование+++++++++Термометрия, измерение АД, ЧСС+++++++++-++------1Определение иодид йодид-иона в плазмекрови, мочеГинекологическое обследование3715304560По показаниямЛабораторные исследования:3212345678910Общий анализ крови+-+++++++Общий анализ мочи+-+++++++Биохимический анализ крови+-+++++++Коагулограмма+-+++++++Общий анализ кала+----+---ИФА на гормоны щитовидной железы+--+-++--(Т3 общ.

и свобод., Т4 общ. и свобод.,ТТГ)Анти ТГ Анти ТПОИнструментальные исследования:ЭКГ+-+------УЗИ органов брюшной полости, почек+-----+--УЗИ щитовидной железы+-----+--ФГДЭС+---+----Порядокзаборабиоматериаловдляизученияфармакокинетикиприоднократном приеме ЛС ФС-1При изучение фармакокинетики ЛС ФС-1 в группах с дозами 5,0 и 10,0 мг/кг приоднократном приеме в каждой группе добровольцы были поделены на 2 подгруппы. Упервой подгруппы забор крови осуществлялся по восходящим точкам: 0, 5′, 10′,20′, 30′, 1ч, 2 ч, 3 ч; у второй – по нисходящим: 0, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч. У группы сдозой ЛС ФС-1 15 мг/кг забор крови осуществлялся по точкам: 0, 5′, 10′,20′, 30′, 1 ч, 2 ч, 3ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч.Сбор проб мочи добровольцев происходил по естественному диурезу до 2-х сутокпосле приема ФС-1.2.4.2 Порядок обследования добровольцев в ходе исследования многократногоприема ФС-1С целью изучения переносимости, безопасности ФС-1 при пероральноммногократном приеме добровольцы принимали ФС-1 1 раз в сутки в течение 60 дней.Субъекты исследования были госпитализированы в стационар на 6 суток, включая -1день до приема ФС-1, и 5 суток ежедневного приема ФС-1, далее после выпискиежедневно приходили для приема ЛС и на контрольные визиты для обследования.33Обследование добровольцев проводилось в соответствии с графиком обследованиятаблица 3.Таблица 3График обследования добровольцев при многократном приеме ФС-1Вид обследованияПериодВ период последующегонахождения в КБнаблюденияДни приема ЛСДо237153045607590Оценка соблюдения режима++++++++++Оценка общего состояния++++++++++Выявление побочных эффектов++++++++++++++++++++Физикальное исследование++++++++++Термометрия, измерение АД, ЧСС++++++++++Жалобы,анамнезнастоящегозаболеванияГинекологическое обследованиеПо показаниямЛабораторные исследования:Общий анализ крови++++++++++Общий анализ мочи++++++++++Биохимический анализ крови++++++++++Коагулограмма++++++++++Общий анализ кала+---+----++---++++++ИФАнагормоныщитовиднойжелезы (Т3 общ.

и свобод., Т4 общ. исвобод., ТТГ)Инструментальные исследования:ЭКГ++---+-+--+----+----УЗИ щитовидной железы+----+----ФГДЭС+---+--+--УЗИоргановбрюшнойполости,почек342.4.3 Порядок забора биоматериалов для изучения фармакокинетики примногократном приеме ЛС ФС-1Для изучения показателей фармакокинетики лекарственного средства ФС-1 примногократном приеме были отобраны биобразцы для определения йодидов у 12добровольцев (3 подгруппы по 4 человека), принимавших ФС-1 один раз в сутки в дозе2,5 мг/кг ежедневно в течение 3-х дней.Забор крови проводился следующим образом: у добровольцев первой подгруппы(n=4) кровь забиралась из вены в первые и третьи сутки, у второй подгруппы (n=4) – навторые и третьи сутки, у третьей подгруппы (n=4) – на первые и вторые сутки.

Начетвертые и пятые сутки забор крови проводился у всех трех подгрупп для определенияβ-фазы элиминации ЛС. Порядок сбора биообразцов представлен в таблице 4.Таблица 4Схема распределения добровольцев по подгруппам и график заборапроб кровиГруппыДни взятияВремя взятия кровикрови105 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч305 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч40-------50-------10-------205 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч305 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч40-------50-------105 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч205 мин15 мин30 мин1ч2ч6ч12 ч40-------50-------1-я2-я3-я352.5Количественное определение йодид-иона в плазме крови добровольцевДля количественного определения йода в плазме крови добровольцев использовалиметод ион-парной обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии(Liun Cui, Iun Wen, Tingtin Zhou, Shuowen Wang, Guorang Fan.

Biomed. Chromatogr. 2009,5, Р. ) с некоторыми изменениями.Реактивы.KI (99,0 %) и октиламин (Sigma, ФРГ). Натрия тиосульфат, краун-6-эфир(1,4,7,10,13,16-гексаоксациклооктадекан), натрия фосфат однозамещенный, кислотафосфорная имели квалификацию «х.ч.» (Sigma, ФРГ). Ацетонитрил был квалификации«для ВЭЖХ» (Biosolve, Нидерланды), другие реактивы имели квалификацию «о.х.ч.».ПриборыРазделение проводили на персональном хроматографе “Beckman-Coulter” (США),состоящем из изократической помпы «System Gold 127», УФ-детектора - «System Gold166» и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм.Условия хроматографирования:Аналитическая колонка – Watman Partisil 10\25 SAX C (2504,6 мм; 5 мкм), Warian,США;детектирование проводили при  - 225 нм.Подвижная фаза – состояла из смеси водной фазы, содержащей 10 мМоль/л 18краун-6-эфир, 5 мМоль/л октиламина и 5мМоль/л натрия фосфата однозамещенного, рНдоводили до 6,0 кислотой фосфорной и ацетонитрила (70:30); скорость потока подвижнойфазы – 1,0 мл/мин.Перед хроматографированием подвижную фазу фильтровали через мембранныйфильтр с размером пор 0,45 мкм и дегазировали на ультразвуковой бане в течение 10 мин.Колонку термостатировали при 28 оС.Приготовление стандартных растворов и образцов для валидации методикиМатричный раствор йодида в концентрации в концентрации 1 мг/мл готовилирастворением KI (13,08 мг) в 10 мл ультра-чистой воды.

Рабочие стандартные растворы сконцентрациями 0, 0,1, 0,25 0,5, 1, 2,5, 5, 10 и 25 мкг/мл готовили из матричного растворав ультра-чистой воде.Калибровочные стандарты готовили разведением рабочих стандартных растворов вводе ультра-чистой до получения концентраций 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25 0,5, 1,0 и 2,5мкг/мл.Приготовление образцов36Хранящиеся при-24 оС,в морозильной камере образцы размораживали прикомнатной температуре.К 500 мкл плазмы крови добавляли равный объем натрия тиосульфата сконцентрацией 5 г/л.

Данное вещество использовали в качестве реактива, преобразующегосвободныййод,вйодид-ион.Смесьперемешивали1минутунавихревомперемешивателе. К полученной смеси для осаждения белков добавляли 1 млацетонитрила. Смесь перемешивали и центрифугировали при 10 тыс. об/мин в течение 10мин.

100 мкл надосадочной жидкости разбавляли 1-3 кратным объемом подвижной фазы и100 мкл полученного раствора вводили в инжектор хроматографа.При хроматографировании образцов мочи добровольцев, к 100 мкл надосадочнойжидкости разбавляли 5-10 кратным объемом подвижной фазы и 100 мкл полученногораствора вводили в инжектор хроматографаВалидация методикиКалибровочные кривые строили после хроматографирования соответствующихкалибровочныхрастворов.Калибровочнаякриваябылалинейнавдиапазонеконцентраций от 0,01 до 2,5 мкг/мл (S=0,005+1022×C r=0,9991).

Предел обнаруженияйодид-иона составил 10 нг/мл.Определение процента извлечения йодид-иона из плазмы кровиПроцентизвлеченияйодид-ионаизплазмыкровиоценивалипотремконцентрационным уровням, сравнивая площади пика йодид-иона до и после осаждениябелков. Полученные данные представлены в таблице 5. Процент извлечения из плазмыкрови в среднем составил 75,6±3,67% (среднее из 3 определений).Прецизионность и правильность методики оценивали по трем концентрационнымуровням рабочих стандартных растворов калия йодида после 6 определений каждогоуровня.

Полученные данные представлены в таблице 6. В этих условиях времяудерживания йодид-иона составило 7,0 мин (рисунок 1).37I-I-а,бI-в38I-I-г, дРис. 1 – Хроматограммы(а – стандартный раствор йодид-иона – 250 нг/мл; б- интактной плазмы кровидобровольца И681; в – плазмы крови добровольца И681 после приема препарата ФС-1 вдозе 0,75 мл/кг через 0,5 час; г – интактной мочи добровольца И477; д – мочи добровольцаИ477 после приема ФС-1 в дозе 0,25 мл/кг через 4,0 час)Таблица 5Процент извлечения йодид-иона из плазмы крови добровольцевВзято (нг/мл)Найдено (%)XSD50,074,678,169,374,04,43100,080,372,777,476,83,84250,078,573,176,776,12,7575,63,6739Таблица 6Метрологические характеристики методики определения йодид-иона в плазмекрови добровольцевВзятоНайдено (нг/мл)(нг/мл)xSDSxx%50,054504651495550,833,311,353,476,83100,010196102971009899,002,370,972,492,52250,0254248251246252254250,833,251,333,421,362.5.1 Статистическая обработка данных фармакокинетикиПолученные данные были подвергнуты математической статистической обработкес помощью программы «Statistica v.6.0».

В таблицах, в которых представленыконцентрации йодид-иона в плазме крови и моче, приведены средние арифметическиезначения ( x ), соответствующие им стандартные отклонения (SD) и стандартные ошибкисреднего значения (Sx). Для расчетов фармакокинетических параметров был использованмодельно-независимый метод. В соответствующих таблицах, кроме ( x ) и (SD), приведеныстандартные отклонения среднего результата (SX), коэффициенты вариации (C.V.) и 95%доверительные интервалы средних значений соответствующих параметров.Для статистической оценки были сделаны предположения о распределенииосновных параметров: параметры AUC0-t и Сmax имеют логарифмически нормальноераспределение.2.6 Статистический анализДля регистрации данных исследования и подготовки данных для последующегостатистического анализа была разработана информационная база данных на основесервера баз данных MySQL версии 5.1.

Для заполнения базы данных была разработанапрограмма«клиент с WEB-интерфейсом» с использованием технологий языка Java(JavaServer Faces v.1.2).Статистическая обработка проводилась с помощью программы SPSS Statistics 17.0.Все качественные показатели были представлены числами (закодированы).40Статистический анализ результатов безопасности и эффективности примененияисследуемого ЛС должен основываться на анализе количественных и качественныхпризнаков:частота и выраженность клинических проявлений;показатели клинико-лабораторных, серологических исследований;объективные и субъективные признаки побочных явлений и переносимостиЛС.Точность оценки определяется частотой (долей), средним значением, стандартнымотклонением, стандартной ошибкой, коэффициентом Стьюдента.2.6.1 Определение объема выборки для изучения переносимости ибезопасности лекарственного средства ФС-1Оценка размера выборки важна для того, чтобы удостовериться в том, что есликлинически или биологически важный эффект существует, то он с высокой степеньювероятности будет обнаружен, - иными словами анализ даст статистически значимыерезультаты.Расчет размера выборки должен базироваться на анализе основных показателейанализов в данном исследовании.