Диссертация (Фармакогностическое изучение и стандартизация почек и листьев смородины черной (Ribes Nigrum L.)), страница 9

61234Незаменимые аминокислоты0,524,260,460,604,920,700,836,800,690,161,310,170,443,610,630,846,891,120,473,850,643,8631,824,4112,1310,65аммиак 47.11Arg 15.953M-His 0.1524 2627231834Trp 0.02His 6.72EA 1.00OH-Lys 1.23Phe 6.60Tyr 5.37Ile 7.74Met 2.51Orn 0.1012Leu 14.88Val 11.97Cys 0.204Pro 13.032Ala 17.05Thr 10.1945OH-Pro 0.29P-Ser 0.18urea 0.021Lys 13.21Gly 25.15Ser 16.301000 mV4,326,576,481,595,9210,526,0141,40Glu 30.65Asp 23.99ТреонинВалинЛизинМетионинИзолейцинЛейцинФенилаланинСуммаОбщая сумма5ch1ch21356789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 minРис. 21.

Хроматограмма аминокислот почек черной смородиныаммиак 7.58His 2.10Arg 5.00L ys 6.55Phe 5.34L eu 12.54T yr 3.11M et 1.54OH -L ys 1.40Orn 0.0356allo-Ile 0.33Ile 6.66Val 8.29Ala 11.11Gly 12.41Cys 0.131Pro 7.20CisOH0.02taurine 0.01urea 0.18T hr 5.36Ser 4.83Asp 12.42Glu 11.39387 mVch1ch2246810121416182022242628303234363840Рис. 22. Хроматограмма аминокислот листьев смородины чернойmin61Идентифицировано 7 незаменимых аминокислот, качественный составкоторых одинаков для листьев и почек. Содержание аминокислот по качественному составу и по количественному содержанию в почках и листьях чернойсмородины имеют незначительные отличия.Следует отметить достаточно высокое содержание аспарагиновой кислоты, которая в совокупности с глютаминовой кислотой и глицином служит нейромедиатором, она стабилизирует процессы нервной регуляции, обладает психостимулирующей активностью [4].

Присутствие ее в сырье подтверждает иммуностимулирующее действие гомеопатических препаратов смородины.4.4. Количественное содержание тритерпеноидов в почках и листьяхПри исследовании качественного состава почек и листьев смородинычерной с помощью реакции с формальдегидом в серной кислоте установленоналичие тритерпеновых сапонинов, что было подтверждено методом хроматографии в тонком слое сорбента.Для количественного определения тритерпеноидов нами был выбранхроматоспектрофотометрический метод. В его основе лежит свойство сапонинов давать окрашивание при взаимодействии с кислотой серной концентрированной.В качестве стандарта был выбран эсцин.

Были исследованы спектры поглощения продуктов реакции эсцина и извлечения из сырья смородины с кислотой серной концентрированной. Измерение проводили с помощью регистрирующего спектрофотометра Саrу 50. Спектры поглощения стандартного раствора и извлечения из почек смородины представлены на рис. 23. Как видно,максимумы поглощения раствора эсцина и извлечения из сырья совпадают инаходятся при длине волны 325±3 нм.При изучении зависимости оптической плотности от концентрации эсцина установлено, что калибровочная кривая зависимости между оптическойплотностью и концентрацией эсцина носит линейный характер в интервалеконцентраций от 0,0005 до 0,004%. Чувствительность определения 0,05 мг/мл62эсцина.

Для расчета количества сапонинов был использован удельный показатель поглощения 222,45 [7].Рис. 23. Спектры поглощения продуктов реакции сапонинов с кислотойсерной концентрированной: 1-0,005% раствор эсцина, 95% этанол; 2извлечение из почек смородиныДля установления максимального извлечения сапонинов из сырья намибыли изучены условия экстракции. Полученные результаты представлены втаблице 7.Таблица 7Зависимость извлечения сапонинов из сырья смородины в зависимости от условий экстракцииУсловия экстракции1Измельченность мм5321Содержание сапонинов, %почки21,872,.172,422,42листья31,872,312,812,8063Продолжение табл. 71231,912,252,372,451,902,312,392,85Экстрагент25% этанол, подкисленный НСl40% этанол, подкисленный НСl70% этанол, подкисленный НСl96% этанол, подкисленный НСlСоотношение сырье - экстрагент1:501:1001:2001:250Время экстракции, мин.

153060902,472,411,951,831,772,342,482,472,872,431,911,811,792,352,842,75Температурный режимБез нагреванияНагревание 30°СНагревание 70°СНагревание 100°СКратность экстракции: двухкратнаятрехкратная1,572.,172,312,492,432,411,492,472,832,542,852,87Оптимальными условиями экстракции являются: измельченность сырья 2мм, экстрагент - 95% этанол, подкисленный кислотой хлористоводородной, соотношение сырье–экстрагент (1:50), экстракция на водяной бане при 100°С,время экстракции 60 мин (двухкратная 45 и 15 мин).Полученные результаты были использованы при разработке методики.Методика.

Около 2,0 г (точная навеска) почек или листьев черной смородины измельчают до размера частиц, проходящих через сито сдиаметром отверстий 2 мм, помещают в круглодонную колбу, прибавляют 60 мл 95% этанола, подкисленного кислотой хлористоводородной, и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. Затем охлаждаютпод струей холодной воды до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, так чтобы сырье не по-64пало на фильтр. К шроту в круглодонной колбе прибавляют 40 мл 95% этанола,подкисленного кислотой хлористоводородной, и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут. Охлаждают под струей холодной воды и фильтруют в ту же мерную колбу. Объем раствора в колбедоводят 95% этанолом, подкисленным кислотой хлористоводородной до метки,перемешивают (раствор А).2 мл раствора А выпаривают на водяной бане досуха.

После охлажденияосадок растворяют в 5 мл воды и помещают в колонку диаметром 1см с 3 галюминия оксида для хроматографии ΙΙ степени активности. Выпарительнуючашку, в которой проводилось выпаривание, промывают 5 мл воды и промывную воду помещают в туже колонку.Водный элюат выпаривают на водяной бане досуха. Осадок после охлаждения количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл 95% этанолом, доводят объем раствора до метки, перемешивают (раствор Б).В две пробирки с притертой пробкой помещают: в первую пробирку 2 мл95% этанола, во вторую - 2 мл раствора Б. В обе пробирки прибавляют по 8 млкислоты серной концентрированной, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.Через 30 минут измеряют оптическую плотность содержимого второйпробирки при длине волны 325 ±3нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения содержимое первой пробирки.Содержание суммы сапонинов в почках или листьях в процентах (х) вычисляют по формуле (1):=, (1)где Д – оптическая плотность испытуемого раствора;– навеска сырья, в граммах;- потеря в массе при высушивании сырья, в процентах65Проведена валидация методики определения суммы сапонинов в сырье.Для установления точности и воспроизводимости методики были проанализированы образцы почек смородины черной и проведена статистическая обработка результатов.

Полученные результаты представлены в табл. 8.Таблица 8Метрологические характеристики методики количественного определения сапонинов в почках смородиныfX¯, мгSx¯P,%T(p,f)92,420,041952,26¯0,093A %3,84Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95не превышает ± 4,0%.Отсутствие систематическойошибки доказано методом добавок стандартаэсцина. Результаты представлены в табл. 9.Таблица 9Результаты количественного определения сапонинов в почках смородины с использованием методов добавок№ Найдено саобпонинов,разца г/100г сырья12342,012,422,442,84Добавленоэсцина,г1,502,212,220,71Должна бытьнайдена суммаэсцина и сапонинов г/100гсырья3,514,634,663,55НайденаОтносисумма эсцина тельнаяи сапонинов ошибка,г/100г сырья%2,604,554,503,65+2,56-1,73-3,43+2,81С помощью разработанной методики были проанализированы образцылистьев и почек смородины черной.

Результаты представлены в табл. 10.66Таблица 10Содержание сапонинов в почках и листьях смородины черной№ образцаСодержание сапонинов,%ПочкиЛистья12,012,8122,422,9432,443,0442,843,1752,923,39Содержание сапонинов в почках смородины колеблется от 2,01 до 2,92%;в листьях от 2,81 до 3,39%.4.5. Определение аскорбиновой кислоты в почках и листьяхСогласно данных литературы в плодах черной смородины аскорбиноваякислота содержится до 500 мг/%, в листьях аскорбиновой кислоты – до 400мг/%, в почках до 100 мг/г свежего сырья [147].Целью данного исследования было: разработка методики количественного определения аскорбиновой кислоты и установление содержания ее в почкахи листьях черной смородины и сравнения полученных результатов.Количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах шиповникапроводят методом титрования раствором 2,6 - дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако, применение этого титранта приводит к получению недостаточновоспроизводимых и точных результатов, что вызвано неустойчивой окраской воттитрованном растворе [16].

Из физико–химических методов используют фотоколлориметрические, экстракционно-фотометрические с хроматографией втонком слое сорбента.Наше внимание привлекли методики количественного определения аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) [8, 15].67В качестве стандарта, при определении, использована аскорбиновая кислота фирмы (Sigma A-5960). Объектами исследования служили почки чернойсмородины, собранные ранней весной, высушенные в проветриваемом помещении в защищенном от света месте.

Исследованиями при подборе оптимальных условий экстракции аскорбиновой кислоты из почек черной смородиныустановлено, что оптимальный выход аскорбиновой кислоты наблюдается приизмельчении сырья до 2 мм, экстрагент – 70 % этанол, соотношение сырья иэкстрагента 1:50, время экстракции 1 час 30 минут при комнатной температуре.Полученные результаты были использованы при составлении методики.Методика. Около 2,0 г (точная навеска) почек, измельченных до размерачастиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляют 60 мл 70 % этанола и взбалтывают на вибрационном аппарате в течение 60 мин.

Затем фильтруют черезбумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобычастицы сырья не попали на фильтр. В колбу со шротом добавляют 40 мл 70 %этанола и извлекают на вибрационном аппарате в течение 30 мин. Извлечениефильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Шрот и фильтр промывают 10 мл 70 % этанола и доводят объем раствора в колбе 70 % этанолом дометки (испытуемый раствор А).5 мл испытуемого раствора А фильтруют через микропористый фильтр сдиаметром пор 0,45 мкм, отбрасывают первые 2 мл фильтрата. Фильтрат (испытуемый раствор Б) хроматографируют с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа не менее 5 повторностей при условиях описанных ниже:По 10 мкл испытуемого раствора Б и раствора РСО аскорбиновой кислоты по отдельности вводят в жидкостной хроматограф высокого давления,укомплектованного системой градиентной подачи элюэнта, УФ диодноматричным детектором или с переменной длиной волны, а так же компьютерной системой сборки и обработки данных.Получают не менее 5 хроматограмм для каждого раствора в следующихусловиях:68мкм;- колонка 250 × 4,6 мм, сорбент Kromosil 100 – 5С18 с размером частиц 5- температура термостата 38° С;- длина волны детектирования 280нм;- подвижная фаза: ацетонитрил (А) / 0,01 % раствор фосфорной кислоты(В);- режим элюирования:Этап №012Продолжительностьэтапа, мин10405Раствор А % Раствор В %58585РежимИзократ.К=1Изократ.951515- скорость элюирования – 1000 мкл/мин;- время регистрации хроматограммы 5 минут.Содержание аскорбиновой кислоты в процентах (Х) в пересчете на на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле (2):=,(2)где: S обр.