Диссертация (Фармакогностическое изучение и стандартизация почек и листьев смородины черной (Ribes Nigrum L.)), страница 10

- среднее значение площадей пика на хроматограмме испытуемого раствора;S ст. – среднее значение площадей пика на хроматограмме РСО аскорбиновой кислоты;а – навеска препарата в граммах;m – навеска стандартного образца аскорбиновой кислоты;W – потеря в массе при высушивании сырья в граммах.Содержание аскорбиновой кислоты должно быть не менее 0,02 %.Примечание.

1.Приготовление подвижной фазы. Используют ацетонитрил для жидкостной хроматографии. Ацетонитрил используют как раствор А. Вмерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 500 мл воды очищенной (ФС42-2119-96), прибавляют 1мл фосфорной кислоты концентрированной (о.с.ч.),доводят объем раствора водой очищенной до метки и фильтруют через микропористый фильтр, при необходимости дегазируют вакуумом в течение 1 - 2 минпри 15 мм атмосферного давления (раствор В). Водную фазу используют свежеприготовленной.692. Приготовление раствора стандартного образца (РСО) аскорбиновойкислоты. Около 0,01 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (Sigma A-59 GO)помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл метанола,перемешивают до растворения. Затем доводят объем раствора метанолом дометки и перемешивают.

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбувместимостью 50 мл, доводят объем раствора метанолом до метки и перемешивают.3. Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографируют РСО аскорбиновой кислоты, получая не менее 5 хроматограмм в условияхописанных выше.Хроматографическая система считается пригодной, если выполняютсяследующие условия:- эффективность хроматографической колонки по техническому паспортудолжна быть не менее 300 теоретических тарелок (ГФ ХI, вып. 1, с. 105);- степень разделения пиков, рассчитанная для пиков на хроматограммеРСО аскорбиновой кислоты должна быть не менее 0,63 (ГФ ХI, вып. 1, с. 105);- относительно стандартное отклонение, рассчитанное для площади пикааскорбиновой кислоты на хроматограмме РСО должно быть не более 3 % (ГФХI, вып.

1, с. 199);- коэффициент асимметрии, рассчитанный по пику аскорбиновой кислотына хроматограмме РСО должен быть не менее 1,0 и не более 1,5;- коэффициент асимметрии пика (Т) рассчитывают по формуле 3:Т=где:, (3)– ширина пика на высоте 5 % от базовой линии, в мин;f – расстояние от начала пика на высоте 5 % от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины, в мин.ВЭЖХ и УФ-спектр аскорбиновой кислоты представлены на рис. 24.70Рис. 24. Хроматограммы и УФ - спектр аскорбиновой кислотыА.- стандартного раствора;В – извлечение из почек черной смородины;С – УФ – спектрМетодика была апробирована с целью еѐ воспроизводимости и точности.Полученные результаты представлены в таблице 11.Таблица 11Метрологические характеристики методики количественного определенияаскорбиновой кислотыfX¯, мгSx¯P,%T(p,f)955,41,008952,26Ошибка единичного определения составляет¯2,2774,11 %.A %4,1171Отсутствие систематической ошибки доказано провидением опытов с добавкой аскорбиновой кислоты.

Результаты анализа представлены в таблице 12.Таблица 12Результаты количественного определения аскорбиновой кислотыс использованием метода добавок№ Найдено асоб- корбиновойразца кислоты,мг/100г сырья12355,447,471,2Добавленоаскорбиновой кислоты, мгДолжна бытьнайдена суммааскорбиновойкислоты,мг/100г сырья27,735,517,883,182,989,0Найденасумма аскорбиновой кислоты,мг/100г сырья85,385,587,0Относительнаяошибка,%+ 2,6+ 3,1- 2,3Результаты показывают отсутствие систематической ошибки, т.к. относительная ошибка метода добавок меньше относительной ошибки единичного определения.На основании разработанной методики проведено сравнительное изучение содержания аскорбиновой кислоты в почках и листьях черной смородины.Установлены существенные колебания в содержании в различных образцах сырья.

Содержание аскорбиновой кислоты в почках черной смородины колеблется от 22,5 до 71,2 мг/%; в листьях от 60,4 до 191,2 мг/%. Полученные результаты представлены в таблице 13.Таблица 13Результаты количественного определения аскорбиновой кислотыв листьях и почках черной смородины№ партии12345Содержание аскорбиновой кислоты, мг/%листьяпочки60,422,577,628,9148,855,4127,347,4191,271,2724.6. Изучение катехинов в почках и листьяхДля количественного определения дубильных веществ используются различные методы: титриметрические, фотокалориметрические, спектрометрические методы и другие. Наиболее перспективным методом в настоящее времяявляется метод ВЭЖХ, позволяющий оценить качественный и количественныйсостав катехинов исследуемого сырья [47].В связи изложенным выше, задачей данного исследования являлось разработка методики определения катехинов в сырье черной смородины, а такжесравнительное изучение состава катехинов и их количественного содержания впочках и листьях черной смородины.Методика.

Около 2,0 г (точная навеска) почек (или листьев) черной смородины, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в круглодонную колбу с притертой пробкой,прибавляют 60 мл 70 % этанола, присоединяют к обратному холодильнику инагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения подструей холодной воды, фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбувместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. К шротув круглодонную колбу прибавляют 40 мл 70 % этанола и повторяют извлечениев течение 15 мин. Затем охлаждают под струей холодной воды и фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Круглодонную колбу, в которой проводили извлечение, и шрот на фильтре промывают 5 мл 70 % этанола.

Доводятобъем извлечения в колбе 70 % этанолом до метки и перемешивают (растворА).5 мл раствора А фильтруют через микропористый фильтр с диаметромпор 0,45 мкм, отбрасывая первые 2 мл. Последующий фильтрат является испытуемым раствором.Условия ВЭЖХ-МС анализа: для разделения на ВЭЖХ системе Agilent1100 использовали колонку Protecol С18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм), октадецилсили-73кагель. Раствор А: 0,1 % раствор муравьиной кислоты, раствор B: ацетонитрил.Скорость подачи подвижной фазы – 0,5 мл/мин, разделение проводили в режиме градиента: 4 – 20 % B – 25 мин; 20 % B – 30 мин; 20 – 50 % B – 50 мин. Масс- спектрометрическое детектирование проводили на времяпролетном масс анализаторе Agilent 6230 в режиме регистрации положительных ионов, потокгаза-осушителя – 9 л/мин, диапазон регистрируемых масс – 100 - 1000 Да.Режим градиентного элюирования катехиновВремя, мин0253050А,%96808050В,%4202050Полученные результаты определения катехинов в почках и листьях черной смородины представлены на хроматограммах (рис.

25 и 26).Рис. 25. ВЭЖХ почек черной смородины: по полному ионному току (верхняя) и УФ – спектру (нижняя)75Рис. 26. ВЭЖХ листьев черной смородины: по полному ионному току (верхняя) и УФ – спектру (нижняя)76Качественный состав катехинов устанавливали по времени удерживания и УФ – спектрам стандартных образцов катехинов. В почках черной смородины идентифицировано 7 катехинов, в листьях – 6 катехинов.

Почки илистья черной смородины содержат одни те же катехины, в листьях отсутствует галлокатехин.Количественное содержание катехинов рассчитывали относительностандартных образцов катехинов. Полученные результаты представлены втаблице 14.Таблица 14Результаты определения катехинов в почках и листьяхчерной смородиныКомпонентГалловая кислотаЭпилгаллокатехинКатехинЭпикатехинЭпигаллокатехин галлатГаллокатехинЭпикатехин галлатВсегоПочки, мг/г0,510,140,670,630,220,010,0162,34Листья, мг/г0,130,080,300,320,090,050,97Таким образом, катехины почек черной смородины отличаются нетолько качественным составом, но и количественным содержанием. Катехинов в почках в два раза выше, чем в листьях черной смородины.774.7. Изучение состава эфирного масла почек черной смородиныВыделение эфирного масла из сырья проводили перегонкой с водянымпаром. Вместо воды использовали насыщенный раствор натрия хлорида.

Прииспользовании насыщенного раствора соли температура кипения жидкой фазы возрастает, в результате чего увеличивается парциальное давление паровлетучих компонентов при сохранении парциального давления паров воды,при этом увеличивается соотношение органической фазы в водной фазе вдистилляте и увеличивается выход масла [27].Выход эфирного масла из почек черной смородины составил 2,74%.Полученное эфирное масло растворимо в эфире, хлороформе, петролейномэфире, бензоле и этаноле.Компонентный состав полученных образцов эфирного масла изучалиметодом газовой хромато-масс-спектрометрии. Исследование проводили наприборе фирмы Agilent Technologies, состоящем из: 1) газового хроматографа7890 (колонка HP-5, 50 м x 320 мкм x 1.05 мкм) и 2) масс-селективного детектора 5975 C с квадрупольным масс-анализатором.

Температурная программа хроматографирования: при 40 °С – изотерма 2 мин; далее программируемый нагрев до 250°С со скоростью 5 °С/мин; при 250 °С – изотерма 15мин; далее программируемый нагрев до 320°С со скоростью 25 °С/мин; при320 °С - изотерма 5 мин. Инжектор с делением потока 1:50. Температура инжектора 250 °С. Температура интерфейса 280 °С. Газ носитель – гелий; скорость потока - 1 мл/мин.