Диссертация (Фармакогностическое изучение и стандартизация почек и листьев смородины черной (Ribes Nigrum L.)), страница 8

Наилучшее разделение наблюдалось при использовании системы растворителей изопропанол - вода (4:1) - извлечение из сырьядает пятно желтого цвета, совпадающее по значению Rf с пятном фруктозы.При опрыскивании хроматограммы резорциновым реактивом, также специфичным на кетозы, с последующим нагреванием при температуре 90 0С в течение 10 мин, наблюдалось пятно розового цвета аналогичной формы и расположения.При опрыскивании хроматограммы второй пластинки дифениламиновымреактивом, специфичным для альдоз (альдогексозы дают коричневое окрашивание, альдопентозы – пурпурное), извлечение из сырья дало пятно серо - коричневого цвета, совпадающее по значению с пятном глюкозы.Таким образом, в почках и листьях черной смородины обнаружены свободные и связанные сахара: фруктоза и глюкоза.На следующем этапе изучали качественный и количественный состав углеводов в почках и листьях черной смородины методом ВЭЖХ.54Свободные сахара определяли по следующей методике: к 100 мг измельченного сырья добавляют 1 мл воды в пробирку с завинчивающей пробкой, нагревают при 90 0С до набухания сырья и экстрагируют углеводы в течение 1 часа при температуре 25 0С при встряхивании.

Полученное извлечение центрифугируют в течение 10 минут при 14000 об/мин, добавляют активированныйуголь, встряхивают и снова центрифугируют 10 мин при 14000 об/мин. Алеквоту 20 мкл супернатанта анализирют методом прямофазной ВЭЖХ на колонкеLiena NH2 4,6×250 мм (5мкм) с подвижной фазой: ацетонитрил – вода (70:30)при скорости потока 1 мл/мин, при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией. Отнесение пиков и расчет концентраций углеводов проводятпо внешнему стандарту, содержащему смесь двух анализируемых углеводов иглицерина в концентрации 10 г/л.Качественный состав свободных углеводов в почках черной смородиныприведен на рис.

19. Как видно свободные сахара в почках черной смородиныпредставлены глюкозой и фруктозой. Аналогичная хроматограмма полученапри анализе листьев черной смородины.Количественное содержание свободных сахаров приведено в табл. 4. Содержание свободных сахаров в почках черной смородины в 5 раз выше, чем влистьях. Содержание свободных сахаров в почках колеблется глюкозы от 3,41% до 3,80 %, фруктозы от 3,15 до 3,77 %; в листьях глюкозы от 0,61 до 0,75 %,фруктозы – от 0,55 до 0,75 %.Таблица 4Содержание свободных сахаров в почках и листьях черной смородиныНаименованиеобъектовПочкиЛистьяСодержание углеводов, %фруктозаглюкоза3,153,803,233,503,773,41Среднее содержание углеводов0,550,620,760,610,630,75Среднее содержание углеводовсумма6,657,037,156,921,171,371,381,3155Для анализа связанных сахаров водные извлечения гидролизовали 1 Мраствором кислоты хлористоводородной при 100 0С в течение 2,5 часов.

Послеисчерпывающего гидролиза центрифугируют 10 мин при 14000 об/мин. К 0,8мл супернатанта добавляют 7,2 мл воды, раствор пропускают через прямофазный концентрирующий патрон (Диасорб С16), отбрасывают первые 3 мл и собирают следующий 1 мл. К 20 мкл раствора смеси стандартов в концентрации 1г/л каждого углевода (внешний стандарт) и исследуемого раствора добавляют20 мкл раствора внутреннего стандарта (раствор глюкозамина) и упаривали навакуумированном центрифужном испарителе типа Speedvaс с подогревом в полипропиленовой пробирке. К высушенной пробе добавляли 20 мкл 0,5 М растворе РМР (1-фенил-3-метил-5-пирозолона) в метаноле и 20 мкл 0,3 М растворагидроксида натрия, тщательно встряхивали на Vortex и термостатировали при70 0С в течение 2 часов.

Пробу нейтрализовали 20 мкл 0,3 М раствором кислоты хлористоводородной и дважды экстрагировали избыток реагента РМР 50мкл бензола. Остаток упаривали на Speedvaс с подогревом и растворяли в 500мкл смеси ацетонитрил – вода в соотношении 1:9.Содержание связанных сахаров определяли методом капиллярного электрофореза, используя прибор Applied Biosystem 273 T. Обработку электрофореграмм осуществляли с помощью той же программы, что и свободных сахаров.Отношение пиков и расчет концентраций углеводов проводили по внутреннему(гликозамин) и внешнему стандарту: смесь пяти анализируемых углеводов вконцентрации 1 г/л.Качественный состав связанных сахаров в почках черной смородиныприведены на рис.

20. Связанные сахара в почках черной смородины представлены арабинозой, глюкозой и галактозой. При анализе связанных сахаров в листьях черной смородины получена хроматограмма, из которой следует, что влистьях черной смородины содержится арабиноза, глюкоза, ксилоза и галактоза(табл. 5). Связанных сахаров в почках черной смородины больше, чем в листьях почти в два раза.

В почках черной смородины содержание связанных сахаров: арабинозы от 4,93 до 5,73 %, глюкозы от 0,70 до 0,85 %, галактозы от 2,8856до 3,90 %, в листьях арабинозы от 0,57 до 0,65 %, глюкозы от 3,13 до 3,17 %,ксилозы от 0,61 до 0,70 %, галактозы от 1,12 до 1,20 %.Таблица 5Содержание связанных сахаров в почках и листьях черной смородиныНаименованиеобъектовПочкиЛистьяСодержание углеводов, %ПентозыГексозыарабинозаглюкозаксилозагалактоза5,720,852,984,930,793,905,730,812,88Среднее содержание углеводов0,603,150,681,120,653,170,611,200,573,130,701,13Среднее содержание углеводовсумма9,559,629,429,535,555,635,435,53Рис.

19. ВЭЖХ углеводов черной смородины. А. смесь стандартов 10 г/л;В. водное извлечение из почек черной смородины57Рис. 20. ВЭЖХ углеводов черной смородины. А. смесь стандартов 1 г/л;В. продукты гидролиза водных извлечений из почек черной смородины4.3. Определение аминокислот в почках и листьяхВ последние годы большое внимание уделяется изучению аминокислот вразличных растительных источниках [32, 46, 61, 107], поскольку они являютсякомпонентами белков, являются исходными веществами при биосинтезе рядабиологически активных соединений.

Аминокислоты проявляют широкийспектр фармакологического действия, участвуют в процессах нервной регуляции функций организма, они необходимы для нормальной работы головногомозга, являясь предшественниками нейромедиаторов [3, 4].Почки смородины содержат аминокислоты, т.к.

реакция со спиртовым реактивом нингидрина положительна. С помощью ТСХ на пластинках «Сорбфил»в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота–вода (4:1:2) и проявителяспиртового раствора нингидрина установлены аминокислоты: глицин, аланин,глютаминовая кислота, метианин.Более детальное сравнительное изучение состава и количества аминокислот почек и листьев черной смородины проведено методом ВЭЖХ.Подготовка образцов: Аналитическую пробу сырья почек или листьевсмородины измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отвер-58стиями размером 0,5 мм.

Пробу массой 1,0 г (точная навеска) помещали круглодонную колбу со шлифом, прибавляли 20 мл 70 % этанола, взвешивали сточностью ± 0,01 г и нагревали на водяной бане с обратным холодильником втечение 1 часа. Затем охлаждали до комнатной температуры, взвешивали и доводили 70 % этанолом до первоначальной массы. Полученное извлечениефильтровали через бумажный фильтр. Первые 10 мл фильтрата отбрасывали.Из последующей порции элюата отбирали 50 мкл и упаривали досуха в вакуумном испарителе фирмы «Servanta» (США). Сухой остаток растворяли в 200мкл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, нагревали на водяной бане втечение 15 мин при температуре 60 0С, перемешивали и центрифугировали втечение 3 мин при 4000 оборотах.

Для анализа использовали 50 мкл полученного гидролизата.Определение качественного состава и количественного содержания аминокислот проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония) на стальной колонке(0,4х 15 см), заполненной катиообменной смолой марки 2619 (Hitachi Customlon-Exchange Resin). Разделение аминокислот проводилось в трех буферныхсистемах натрий – цитратных буферных растворов: 0,18 Н рН 3,25; 0,3 Н рН3,9; 1,6 Н рН 4,75.

Нингидриновый реактив приготовили с использованием метилового эфира этиленгликоля. Цитратные буферные растворы подавали в колонку по стандартной программе со скоростью 32 мл/час. Нингидриновый реактив подавали со скоростью 20 мл/час. После выхода из аналитической колонки разделенные аминокислоты смешивались нингидриновым реактивом в смесительном блоке в соотношении 2:1.

Реакция аминокислот с нингидриновымреактивом проходила за 4 мин при 1000С в реакционной бане. Колориметрическое измерение окрашенных комплексов, образующихся в результате реакции снингидрином, проводилось непрерывно и одновременно при двух длинах волн.Первичные амины образовывали пурпурную окраску, измеряемую при длиневолны 570 нм, а вторичные (пролин и оксипролин) - желтую окраски, измеряемую при длине волны 440 нм.59Как следует из экспериментальных данных, в почках смородины содержится 19 аминокислот, в листьях – 18 аминокислот.

В листьях отсутствует аминокислота оксипролин (рис. 21, 22).Общее содержание аминокислот в почках немного выше, чем в листьях исоставляет 12,13 % и 10,65 % соответственно. Преобладающими аминокислотами являются: аспарагиновая кислота (в почках - 11,23 %, в листьях – 11,17%); глютаминовая кислота (в почках - 15,90 %, в листьях – 11,36 %); глицин (впочках - 6,64 %, в листьях – 6,39 %); лейцин (в почках - 6,89 %, в листьях –10,59 %); лизин (в почках - 6,80 %, в листьях – 6,48 %); (в почках - 9,75 %, в листьях – 5,92 %) (табл. 6).Таблица 6Содержание аминокислот в почках и листьях черной смородиныАминокислоты1ПролинАспарагиноваякислотаГлутаминоваякислотаСеринГлицинАланинОксилизинАргининГистидинЦистинТирозинОксипролинСуммаПочкиЛистьяСодержание Содержание Содержание Содержаниеаминокислот,от суммыаминокислот,от суммы%свободных%свободныхкислот, %кислот, %2345Заменимые аминокислоты0,645,250,605,631,3711,231,1911,171,9415,901,2111,360,740,810,650,011,190,450,030,420,028,276,066,645,330,749,753,690,253,440,1668,180,370,680,720,170,630,240,020,416,243,476,396,761,605,922,950,193,8758,6060Продолжение табл.