Диссертация (Фармакогностическое изучение и стандартизация почек и листьев смородины черной (Ribes Nigrum L.)), страница 5

Сырьем для получения настойки служатсвежие листья Ribes nigrum L., получение настойки осуществляется согласнометоду, приведеннному в Фармакопее. Монография на настойку нормирует длясырья: описание, включая микроскопию, влажность. Для НГМ определяетсяподлинность методом ТСХ, также нормируется количество суммы флавоноидом (не менее 0,1% в пересчете на рутин), определенное спектрофотометрическим методом.Гомеопатические фармакопеи Германии, США, Великобритании и Индиине содержат монографий на сырье и настойки гомеопатические матричныеRibes nigrum [41, 119, 157].Наряду с черной смородиной в гомеопатии применяются также препараты из листьев красной смородины Ribes rubrum L.

[41, 146].25Смородина черная входят в перечень гомеопатических препаратов, разрешенных к применению в соответствии с приказом Минзравмедпрома № 335[57]. Однако отечественная нормативная документация на сырье и гомеопатическую настойку смородины черной в настоящее время отсутствует.26ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 11. Проведен анализ отечественной и зарубежной научной литературы повопросу изученности лекарственного растительно сырья смородины черной инормативной документации, регламентирующей качество гомеопатических лекарственных средств.2. Выявлены условия местообитания, заготовки и сушки сырья смородины черной, однако недостаточно сведений по морфолого-анатомическомустроению почек и листьев смородины и установлению диагностических признаков, необходимых для идентификации сырья.3.

Приведены сведения об изученности химического состава смородинычерной, но мало данных о сравнительном изучении качественного состава и количественного содержания БАВ в листьях и почках черной смородины.4. На основании данных литературы установлено, что недостаточно изучен вопрос стандартизации лекарственного растительного сырья и настоек гомеопатических матричных, разработки показателей подлинности и качества.5. Учитывая вышесказанное, разработка отечественной нормативной документации на сырье и настойки гомеопатические матричные из двух видовсырья (высушеннных и свежих листьев) является актуальной проблемой ипредставляетинтересдляфармации.27ЧАСТЬ II.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГлава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследованияВ качестве объектов исследования служили почки, собранные в апреле,листья, собранные в июле-августе свежие или высушенные дикорастущего иликультивируемого растения смородина черная - Ribes nigrum L., семейство камнеломковые – Saxifragaceae (крыжовниковые – Grossulariaceae). Были использованы образцы сырья, собранные в различных регионах Европейской частиРоссии, как более северных, таких как Вологодская область, так и более южных, таких как Рязанская область (табл. 2).Таблица 2Опытные образцы почек и листьев черной смородины (Ribes nigrum L.)СырьеПочкиМесто сбора(области)ВологодскаяМосковскаяТамбовскаяРязанскаяПермскаяЛистья-»-СортаДикорастущиеКультурные:«Память Мичурина»«Тамбовская»«Голубка»«Кент»-»-Время сбора(2010/2014 гг)АпрельИюль- август2.2.

Материалы и методы исследованияВ работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающиетребованиям соответствующей нормативной документации.Исследования макроскопических и микроскопических признаков сырьявыполнялись в соответствии c с требованиями фармакопейных статей ГФ XI«Листья» и «Техника микроскопического и микрохимического исследованиялекарственного растительного сырья [16]. Готовые препараты изучали подмикроскопом МБН-3 (при увеличении х105; х104; х200; х210; х225; х300;28х450). Результаты документировали с помощью фотоаппарата «Зенит» с микронасадкой МФН-12 в виде фотографий.Получение НГМ проводилось в соответствии с ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные» из высушенных листьев по методу 4а и изсвежих листьев смородины черной по методу 3 [52]. Определение числовыхпоказателей матричных настоек (плотность, сухой остаток, микробиологическая чистота) проводили в соответствии с ГФ XI, ГФ XII [16, 17].Для стандартизации сырья и НГМ проведена разработка соответствующих методик идентификации и количественного определения активных компонентов на основе анализа данных литературы и нормативной документации [51,52].Идентификацию биологически активных веществ проводили качественными реакциями и методом ТСХ на пластинках «Sorbfil» (Россия) в системахрастворителей: 1) изопропанол–вода (40:10); 2) спирт н-бутиловый -кислота уксусная ледяная-вода (40:10:20); 3); бензол-этилацетат (20:10); 4) бензолэтилацетат-ацетон (96:8:1); 5) хлороформ-метанол-вода (20:10 до насыщения);6) бензол-диоксан-кислота уксусная (90:25:4); хлороформ-метанол (90:10).Качественный и количественный анализ аминокислот определяли нааминокислотном анализаторе фирмы «Хитачи», модель 835 на стальной колонке (0,4 х 15 см), заполненной катионообменной смолой марки 2619 (HitachiCustom Ion-Exchange Resin) [2, 22, 63].Свободные углеводы анализировали методом прямофазной ВЭЖХ на колонке Luna 100 - 5 NH2 4,6 х 250 mm (5 мм) с подвижной фазой: ацетонитрил вода (70:30) при скорости потока 1 мл/мин, при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией.

Содержание связанных сахаров определяли методом капиллярного электрофореза, используя прибор Applied Biosystem 273 T.[35, 45, 62].Определение тритерпеновых сапонинов проводили спектрофотометрическим методом на регистрирующем спектрофотометре Саrу 50 [73, 74, 80].29Количественное определение аскорбиновой кислоты проводили методомВЭЖХ на хроматографе, укомплектованном системой градиентной подачиэлюента, в условиях: колонка 250 × 4,6 мм, сорбент Kromosil 100 – 5С18 с размером частиц 5 мкм; температура термостата 38° С; длина волны детектирования 280 нм; подвижная фаза: ацетонитрил (А) / 0,01 % раствор фосфорной кислоты (В); режим элюирования скорость элюирования – 1000 мкл/мин; времярегистрации хроматограммы 5 минут [8, 15, 150].Определение качественного состава флавоноидов проводилось методомвысокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе WatersAcquility с тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters), подвижная фаза А: вода – ацетонитрил (95 : 5) с муравьиной кислотой., подвижная фаза В: ацетонитрил с муравьиной кислотой.

Количественное определение флавоноидов проводили методом спектрофотометрии на спектрофотометре Cary 50Scan после реакции с алюминия хлоридом [64, 143, 152].Качественное и количественное определение катехинов в почках и листьях черной смородины проводили методом ВЭЖХ-МС на приборе Agilent 1100,использовали колонку Protecol С18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм), октадецилсиликагель.Раствор А: 0,1 % раствор муравьиной кислоты, раствор B: ацетонитрил.

Скорость подачи подвижной фазы – 0,5 мл/мин, разделение проводили в режимеградиента: 4 – 20 % B – 25 мин; 20 % B – 30 мин; 20 – 50 % B – 50 мин. Масс спектрометрическое детектирование проводили на времяпролетном масс - анализаторе Agilent 6230 в режиме регистрации положительных ионов, поток газаосушителя – 9 л/мин, диапазон регистрируемых масс – 100 - 1000 Да.

[47, 75,163].Компонентный состав полученных образцов эфирного масла изучали методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Исследование проводили на приборе фирмы Agilent Technologies, состоящем из: 1) газового хроматографа 7890(колонка HP-5, 50 м x 320 мкм x 1.05 мкм) и 2) масс-селективного детектора5975 C с квадрупольным масс-анализатором.

Температурная программа хроматографирования: при 40 °С – изотерма 2 мин; далее программируемый нагрев30до 250°С со скоростью 5 °С/мин; при 250 °С – изотерма 15 мин; далее программируемый нагрев до 320°С со скоростью 25 °С/мин; при 320 °С - изотерма 5мин. Инжектор с делением потока 1:50. Температура инжектора 250 °С. Температура интерфейса 280 °С. Газ носитель – гелий; скорость потока - 1 мл/мин.Хроматограмма образцов – по полному ионному току. Условия массспектрометрического анализа: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс-спектров в положительных ионах в диапазоне (m/z) от 20 до 450со скоростью 2.5 скан/сек. Программное обеспечение – ChemStation E 02.00.Качественный анализ проводили по библиотеке полных масс-спектров NIST-05и соответствующим значениям хроматографических линейных индексов удерживания (I). Относительное содержание (%) компонентов смеси (количественный анализ) вычисляли из соотношения площадей хроматографических пиков(методом простой нормировки) [76, 128].При разработке методик качественного и количественного определенияосновных групп БАВ были использованы стандарты: рутин (ФC 42-2508-87),кемпферол (CAS N 520-18-3); кислота галловая ([149-91-7] Merck); эпигаллокатехин (CAS N 970-74-1, Sigma-Aldrich); катехин (CAS N 154-23-4); эпикатехин(CAS N 490-46-0, Alfa Aesar); эпигаллокатехин галлат (CAS N 989-51-5, AlfaAesar); галлокатехин (CAS N 3371-27-5, Sigma); эпикатехин галлат (CAS N1257-08-5, Alfa Aesar); кверцетин (CAS 117-39-5); кислота олеаноловая (CAS N508-02-1); кислота хлорогеновая (Sigma, Lot 56 H7700); кислота коричная (CASN 140-10-3, Acros); глюкоза (CAS N 50-99-7); фруктоза (CAS N 57-48-7); арабиноза (CAS N 10323-20-3); ксилоза (CAS N 58-86-6); галактоза (CAS N 59-23-4);эсцин (CAS N 11072-93-8); кислота аскорбиновая (ФС 42-2668-95, CAS N 5081-7, Sigma A-59 G0).При обработке полученных результатов применяли метод вариационностатистического анализа с использованием критерия достоверности по Стьюденту в соответствии с требованиями ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [17].31Глава 3.

ИССЛЕДОВАНИЕ АНАТОМО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХПРИЗНАКОВ ЛИСТЬЕВ И ПОЧЕК ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ3.1 Изучение анатомического строения листьев черной смородиныСвежие листья смородины чернойВнешние признаки. Листья цельные или частично измельченные длинночерешковые, 3 – 5 – лопастные, с двояковильчатым краем, сверху голыетусклые, снизу – серые, по жилкам пушистые и усажены точечными золотистыми железками, издающими специфический запах. Вкус водного извлечениягорьковатый.Микроскопия. При рассмотрении листа с поверхности видны с верхнейстороны клетки эпидермиса с сильноизвилистыми, извилистыми и слабоизвилистыми стенками, длиной 21-62 мкм, шириной 12-33 мкм; с нижней стороны со слабоизвилистыми, извилистыми и сильноизвилистыми, длиной 8-71 мкм,шириной 6-38 мкм (рис.

1, 2). Стенки клеток с обеих сторон местами четковидно утолщенные (чаще вдоль жилок и по краю листа). Клетки эпидермиса вдольжилок вытянутые прямоугольной, веретеновидной и комбинированной формы,крупнее, чем на всей поверхности листа. Кутикула с обеих сторон листа ровная.Устьица аномоцитного типа расположены с нижней стороны листа (длиной 1725 мкм, шириной 8-25 мкм) расположены с частотой 137-431 на 1 мм2.