Диссертация (Фармакогностическое изучение и стандартизация почек и листьев смородины черной (Ribes Nigrum L.)), страница 7

ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЛИСТЬЯХ И ПОЧКАХ СМОРОДИНЫ ЧЕРНОЙ (RIBES NIGRUM L.)4.1. Определение основных групп БАВ в сырье качественными реакциямии методом ТСХИсследование качественного состава почек и листьев черной смородиныпроводили в несколько этапов: приготовление спирто – водного извлечения,фракционирование природных соединений, качественная идентификация веществ.

Извлечение биологически активных веществ из почек смородины проводили путем нагревания на водяной бане с обратным холодильником с 40%спирта этилового при соотношении 1:50.На втором этапе проводили фракционирование биологически активныхсоединений, для чего водно-спиртовое извлечение переводили в водное путемотгона этанола под вакуумом.

Хлорофорную фракцию получали путем извлечения БАВ из водной фракции в делительной воронке хлороформом. Затемводное извлечение обрабатывали этилацетатом аналогичным способом, получая этилацетатную фракцию. Эту же водную фракцию использованиядля получения бутанольной фракции по методу, описанному выше. Водный остатокупаривали под вакуумом досуха.

Сухой остаток растворяли в воде.Для очистки водного извлечения от полифенольных соединений его пропускали через колонку с алюминия оксидом. Получали очищенное водное извлечение. В очищенном водном извлечении определяли углеводы и аминокислоты, в неочищенном водном извлечении – дубильные вещества, в хлороформной фракции – стероиды, кумарины, в этилацитатной и бутанольной фракциях– фенольные соединения..Таблица 3Определение основных групп БАВ в сырье качественными реакциями и методом ТСХГруппа БАВМетод: 1.

Качественные реакции; 2. Метод ТСХ (ПФ, обнаружение, зоны)1Углеводы (своб. и связ. сахара, по-21. Реактив Фелинга: красно- оранжевый осадок. Водное извлечение + 95 % эта-лисахариды)нол: отсутствие белого осадка.2. ПФ: изопропанол – вода (4:1); дифениламиновый и резорциновый реактив.Раствор сравнения: желтая (фруктоза), Rf ~ 0,75; розовая (глюкоза), Rf ~ 0,66Исследуемый раствор: желтая, Rf ~ 0,75; розовая, Rf ~ 0,66Аминокислоты1. Раствор нингидрина: сине-фиолетовое окрашивание.2.

н- бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:2).; нингидриновый реактив.Раствор сравнения: зоны сине-фиолетовые :Rf ~ 0,13 (глицин), Rf ~ 0,19 (аланин),Rf ~ 0,25(глютаминовая кислота), Rf ~ 0,35 (метианин)Исследуемый раствор: : зоны сине-фиолетовые :Rf ~ 0,13, Rf ~ 0,19, Rf ~ 0,25, Rf ~0,3548Продолжение табл.

312Кумарины 1. 10% спиртовый р-р калия гидроксида: желтое окрашивание; р-р диазотированной сульфаниловой кислоты: красное окрашивание.2. бензол-этилацетат (2:1); УФ-свет; р-р калия гидроксидаУФ – свет, 360 нм: Исследуемый раствор: желто-зеленая, с Rf ~ 0,04, зеленая, Rf ~ 0,59, зеленая, Rf ~ 0,87,голубая, Rf ~ 0,92;10 % спиртовый раствор едкого кали: Исследуемый раствор: зоны желтого цвета с Rf ~ 0,35, Rf ~ 0,45 и Rf~ 0,51.Стероиды 1. Реакция Либермана-Бурхарда (уксусный ангидрид +и концентрированная серная кислота): образуетсякрасно-фиолетовое кольцо.2.

ПФ: бензол-этилацетат-ацетон (98:8:1); 10 % спиртовый р-р серной кислоты.Раствор сравнения: фиолетовая, Rf ~ 0,30 (β- ситостерол)Исследуемый раствор: фиолетовая, Rf ~0,07; фиолетовая, Rf ~0,12; синяя, Rf ~0,18; фиолетовая, Rf ~0,25;фиолетовая, Rf ~0,30; светло-зеленая, Rf ~0,35.49Продолжение табл. 312Тритерпеноиды 1. Формальдегид в серной кислоте: грязно-красно-коричневое окрашивание на границе слоев и зеленоеокрашивание верхнего слоя.2. ПФ: хлороформ-метанол-вода (2:1:вода до насыщения); 10 % спиртовый раствор серной кислотыРаствор сравнения: красная, Rf ~ 0,40 (олеаноловая кислота)Исследуемый раствор: зоны красного цвета с Rf ~0,67; Rf ~0,70; Rf ~0,85; Rf ~0,92.Флавоноиды1. Цианидиновая проба (цинк +конц.

хлористоводородная к-та): малиновое окрашивание. С растворомаммиака: темно-желтое окрашивание.2. ПФ: н-бутанол –кислота уксусная –вода (4:1:2); спиртовый р-р алюминия хлорида.Раствор сравнения: зоны желтого цвета с Rf ~ 0,57 (кемпферол), Rf ~ 0,64 (мирицетин), Rf ~0,74(кверцетин)Исследуемый раствор: зоны желтого цвета с Rf ~ 0,37; Rf ~ 0,57; Rf ~ 0,64; Rf ~0,74.50Продолжение табл.

31Фенолкарбоновые ки-21. Общая реакция на фенольные соединения с железа (III) оксидом.слоты2. ПФ: бензол-диоксан- кислота уксусная (90:25:4); 1 % р-р калия перманганата.Раствор сравнения: зоны желтого цвета с Rf ~ 0,46 (коричная кислота), с Rf ~ 0,67 (хлорогеновая кислота).Исследуемый раствор: зоны желтого цвета с Rf ~0,09; Rf ~0,17; Rf ~0,46; Rf ~0,67.Иридоиды1.

Гидроксиламин + хлорид железа (III): красное окрашивание.2. ПФ: хлороформ-метанол (9:1); реактив Шталя (5 мл концентрированной хлористоводороднойкислоты, и 1 г п-диметиламинобензальдегида, 95 мл 95% спирта)Исследуемый раствор: зоны сине-зеленого цвета с Rf ~0,11; Rf ~0,40; Rf ~0,46; Rf ~0,71.Дубильные вещества2. ПФ: хлороформ-метанол (9:1); реактив Шталя.Исследуемый раствор: зоны красно-малинового цвета с Rf ~0,22; Rf ~0,55; Rf ~0,78; Rf ~0,81.Аскорбиновая кислота 2.

ПФ: вода; обнаружение - 5 % р-р кислоты фосфорномолибденовой.Исследуемый раствор: зоны синего цвета Rf ~ 0,85.51Качественный состав БАВ определяли цветными реакциями, приведеннными в литературе, и методом ТСХ [23, 50, 79, 91, 129, 148, 158]. При использовании метода ТСХ в качестве сорбента применяли «Сорбфил», в качествесистем растворителей и детектирующих реагентов были использованы компоненты соответствующие классу исследуемых соединений (табл. 3).Определение фенольных соединений.

Предварительный анализ состоит изкомплекса цветных реакций. Общей реакцией на фенольные соединения является взаимодействие извлечений с железа окисного хлоридом. Реакция положительна. Качественной реакцией на флавоноиды является цианидиновая проба:при добавлении к этилацетатной и бутанольной фракции концентрированнойхлористоводородной кислоты и кристаллического цинка, при нагревании образуется малиновое окрашивание. Реакция положительна. Реакция с растворомаммиака на оксикоричные кислоты и флавоноиды дает темно-желтое окрашивание, что свидетельствует о присутствии этих соединений.

Реакция на оксикоричные кислоты с диазотированным бензидином дает желтое окрашивание. Оксикоричные кислоты присутствуют.Таким образом, проведенное скрининговое исследование основных группБАВ качественными реакциями и методом ТСХ, позволило установить в почках и листьях черной смородины наличие углеводов (в том числе свободных исвязанных сахаров при отсутствии полисахаридов), аминокислот, кумаринов,стероидов, тритерпеноидов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, иридоидов, дубильных веществ и аскорбиновой кислоты.Дальнейшее более детальное исследование было проведено по нескольким классам соединений.4.2. Определение углеводов в почках и листьяхВ качестве объектов служили листья и почки черной смородины.В сырье определяли качественный и количественный состав углеводовпоэтапно: на первом этапе идентифицировали сахара с помощью качественныхреакций; на втором этапе определяли сахара с помощью хроматографии в тон-52ком слое сорбента (ТСХ); на третьем этапе определяли качественный и количественный состав углеводов с помощью метода высокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ).Методика.

В круглодонную колбу вместимостью 250 мл помещают 5 гпочек или листьев, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито сотверстиями диаметром 2 мм, прибавляют 60 мл 40 % этанола и нагревают накипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 100 мл.

Экстракцию повторяют с 40 мл 40 % этанола в течение 15 мини после охлаждения фильтруют в ту же мерную колбу. Объем раствора в колбедоводят 40% этанолом до метки и перемешивают. Извлечение упаривают подвакуумом до 30 мл (раствор А).Для очистки от полифенольных соединений 15 мл раствора А пропускаютчерез колонку диаметром 1 см с 3 г алюминия оксида для хроматографии (IIстепени активности) – получают очищенное водное извлечение (раствор Б).Свободные сахара определяют реакцией Бертрана с реактивом Фелинга. К1 мл раствора Б прибавляют 1 мл жидкости Фелинга (смесь реактива 1 и реактива 2) и нагревают на кипящей водяной бане. Реакция положительна – выпадает красно – оранжевый осадок (I) меди оксида.К 1 мл раствора Б прибавляют 1 мл кислоты серной разведенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин (Раствор В).

После охлажденияк 1 мл гидролизата добавляют 1 мл реактива Фелинга и нагревают на кипящейводяной бане; наблюдается выпадения красно- оранжевого осадка, объем которого превышает объем осадка до проведения гидролиза. Таким образом, в почках и листьях черной смородины содержатся как свободные, так и связанныесахара.Отсутствие белого осадка при добавлении трехкратного объема 95 % этанола к водному извлечению свидетельствуют об отсутствии в почках смородины полисахаридов.53Полученные данные подтверждены методом ТСХ на пластинках СорбфилПТСХ – АФ – УФ. Хроматографирование проводили в системах растворителей:95 % этанол; 70 % этанол; вода; изопрапонал – вода (3:1); изопропаноол – вода(4:1).На линию старта хроматографической пластинки наносили по 0,001 млраствора Б и 5 % раствора фруктозы.

На линию старта второй хроматографиической пластинки наносили по 0,001 мл раствора В и 5 % раствора глюкозы.После прохождения фронтом растворителей 12 см пластинки вынимали из камеры, высушивали на воздухе. Пластинку обрабатывали детектирующими реагентами: антроновым, резорциновым и дифениламиновым реактивами. Хроматограмму первой пластинки погружают в реактив 1 антронового реактива, высушивали на воздухе, затем опрыскивали реактивом 2 антронового реактива инагревают в сушильном шкафу при температуре 108 0С в течение 6 мин. Реактив специфичен на кетозы и пентозы (моно-, ди -, три- полисахариды, содержащие кетогексозы дают желтую окраску, кетопентозы - пурпурную, кетогептозы – оранжево – желтую).