Диссертация (Характеристика грибов рода Candida, выявляемых у ВИЧ-инфицированных пациентов), страница 7

методом ПЦР-РВ,«АмплиСенс C.albicans / C.glabrata /C.krusei-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» INTEGRALSYSTEM YEASTS plus.50Фотография 9. Проведение теста на ассимиляционную реакцию приидентификации Candida spp. методом ПЦР-РВ, «АмплиСенс C.albicans /C.glabrata /C.krusei-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» INTEGRAL SYSTEM YEASTS plusКомбинацияположительныхиотрицательныхответовпозволяласформировать цифровой код, который дает возможность идентифицироватьисследуемые дрожжи с помощью таблицы кодов.Определение чувствительности к противомикотическим препаратам.

Тестыоценивались по росту или ингибированию дрожжей в среде, содержащейпротивогрибковый препарат и индикатор роста в лунках.512.2.4 Идентификация Candida spp. при помощи КАНДИДАтест21Набор КАНДИДАтест 21 использовали для идентификации патогенныхгрибов, при использовании стандартизированных реакций и компьютерной базыданных в течении 24 часов.Чистую культуру грибов рода Candida выделяли, пользуясь общепринятымив микробиологии методами на Сабуро-Глюкоза 2% агаре (без добавок).Из 24-часовой культуры готовили бактериальную суспензиюинокулировали по 1 мл суспензии во все лунки КАНДИДАтест21,затем инкубировали инокулированную пластинку в течение 24 часов притемпературе 25-30 С.После 24 часовой инкубации проверяли чистоту культуры на контрольнойчашке.

При отсутствии роста увеличивали время инкубации на 24 часа.Учитывали все результаты биохимических реакций, основанных на ассимиляции.Результаты записывали и интерпретировали с помощью прилагаемых таблиц.2.2.5 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивногокандидозаОсобенности морфологии клеток культур грибов рода Candida изучали спомощью флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z1 (Carl Zeiss, Германия),использующего оптику Номарского.

Для этого готовили микропрепараты: напредметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, в которую вносиликультуру исследуемого изолята Candida spp., взятую бактериологической петлей сцентральной и периферической поверхности колонии, полученную суспензиюнакрывали покровным стеклом и изучали особенности морфологии.2.2.6 Диско-диффузионный метод определения чувствительности CLSI M44-AИспользовали бумажные диски (производство Oxoid, Великобритания)52диаметром 6 мм, пропитанные противогрибковыми препаратами (диски свориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом – 25 мкгпрепарата) и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2%глюкозу и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего [45]. Для приготовленияинокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp.Мутность инокулюма соотвествовала 0,5 McFarland (1х106 - 5х106 клеток/мл).Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 минут с моментаего приготовления.

Стерильный хлопковый тампон несколько раз погружали винокулюм, затем переносили в чашку Петри со средой Мюллер-Хинтон ирастирали по всей поверхности среды, постепенно вращая тампон, дляполучения роста «газоном» и полного впитывания инокулюма в среду.Диски с флуконазолом и вориконазолом наносили стерильным пинцетомна поверхность засеяной чашки, слегка придавливая для получения наибольшейплощади соприкосновения со средой. Инкубировали при температуре 35 0С 1824 часа.

Учет результатов проводили по диаметру зоны задержки роста [табл.2].[Фотография 10].53Фотдисками с антимикотиками.Таблица 8 – Критерии интерпретации метода М44-АЗадержказоны ростаCandida spp.Фотография 10. Задержка зон роста Candida spp. на среде Сабуро снанесенными дисками с антимикотиками.Таблица 2.Критерии интерпретации результатов метода М44-А.Категория чувствительностиЧувствительный (Ч)Умеренно-чувствительный (УЧ)Устойчивый (У)ФлуконазолДиаметр,МПК,мммкг/мл> 1915-18< 14<816-32> 64ВориконазолДиаметр,МПК,мммкг/мл> 1714-16< 13<12-4>62.3 Статистическая обработка результатовРезультаты исследования обрабатывали с помощью программы STATISTICA54for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и параметрическиеметоды. Критерием статистической достоверности получаемых данных считалиобщепринятую в медицине величину р <0.05 [12].55ГЛАВА 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.Всего получено 84 изолята идентифицированных как грибы рода Candida, вт.ч. C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei. C.albicans доминировала почисленности (табл. 3, диаграмма 1).Был произведён анализ изменения видового состава Candida spp.,полученных при исследовании мазков из ротоглотки и кишечника в 2015 и 2017гг[диаграмма 2, таблица 3].Таблица 3.ИзменениеспектрагрибовродаCandida,выделенныхотВИЧ-инфицированных пациентов в 2015 и 2017гг.2015 г. % от общего2017 г.

% от общего числачисла изолятовизолятовC. albicans3756,8C. glabrata59,310,8C. tropicalis018,9C. krusei3,713,556Диаграмма 2. Изменение спектра грибов рода Candida, выделенных от ВИЧинфицированных пациентов в 2015 и 2017гг.Видовой состав грибов рода Candida изменился к 2017г. (p <0,05) за счетвытеснения C. glabrata (43,8% в 2015г и 10,8% в 2017г) штаммами C. crusei (0% в2015г и 13,5% в 2017г) и C.

tropicalis (0% в 2015г и 18,9% в 2017г).В 2017 г. стали высеваться C. tropicalis, повысилось долевое участие C.albicans и C. krusei (соответственно в 1,54 и 3,65 раз, p>0,05). В то же время, пулC. glabrata в 2017 г. был существенно сокращен - в 5,49 раза (p <0,001).Следовательно, анализ динамики видового состава грибов рода Candida показалего существенное изменение в 2017г., по сравнению с данными 2015г. [диаграмма2].По данным корреляционного анализа, C. albicans конкурирует с другими57видами грибов данного рода – обнаружена отрицательная связь средней силы с C.glabrata (r=-0,418), C.

tropicalis (r=-0,529) и C. krusei (r=-0,475).Среднее количество изолятов, полученных от одного пациента, в общемсоставило 1,60. При этом оно также не было постоянным, а заметно возросло с1,29 в 2015 г. до 1,95 в 2017 г., т.е. увеличилось в 1,51 раза и свидетельствует отом, что в образцах 2017г. Сandida spp. демонстрировали большую тенденцию кобразованию ассоциаций.Было проанализировано изменение долевого участия гетерогенныхассоциаций грибов рода Candida у ВИЧ-инфицированных пациентов в 2017г., посравнению с 2015г [табл.4, диаграмма 3].Таблица 4.Изменение долевого участия гетерогенных ассоциаций грибов рода Candidaу ВИЧ-инфицированных пациентов в 2017г., по сравнению с 2015г.Число2015 г. %( по2017 г.

%( покомпонентовотношению к общейотношению к общейассоциациипопуляции Candida spp.)популяции Candida spp.)175,047,3220,031,63015,845,05,358Диаграмма 3. Изменение долевого участия гетерогенных ассоциаций грибоврода Candida у ВИЧ-инфицированных пациентов в 2017г., по сравнению с 2015г.Установлено, что если в 2015 г. лишь у 25,0% пациентов обнаруживалисьассоциации грибов рода Candida, то в 2017 г.

их доля возросла в 2,10 раза идостигла 52,6%. При этом наибольшую долю среди ассоциаций составлялибинарные ассоциации в различном сочетании. [диаграмма 3].Из представленных данных следует, что в 2017г. впервые выявляютсятрехкомпонентные ассоциации, и возростает долевое участие двухкомпонентныхассоциаций.Был произведен анализ компонентной структуры выделенных ассоциацийCandida spp. с целью установки наиболее часто встречающихся вариантов [табл.5].59Таблица 5.Частота вариантов ассоциаций грибов рода Candida у ВИЧинфицированных пациентов 1 и 2 группы.Варианты ассоциации2015 г.2017 г.%%Гомогенные60,060,0Гетерогенные40,040,0Выделенные изоляты грибов рода Candida в большинстве случаев (60%),представляли собой гомогенные ассоциации, состоящие из Candida albicans, как в2015, так и в 2017гг.

В то время как гетерогенные популяции былимноговариантными и в их состав входили различные представители рода Candidaв различных сочетаниях.Таким образом, анализ компонентной структуры ассоциаций показал, чтоих гомогенные варианты, включающие микробы только одного вида, встречаютсяв 1,60 раза чаще, чем гетерогенные [табл. 5]. При этом выборки пациентов 2015 и2017 гг. практически не различались по данной характеристике.3.1 Эффективность антимикотиков различных фармакологическихгрупп в отношении Candida spp., выделенных из различных биотопов(ротоглотка, кишечник) от ВИЧ-инфицированных пациентов.В соответствии с поставленными целями исследования, нами было изученоизменение видового состава грибов кандида после применения флуконазола, какпрепарата первой линии для лечения кандидоза в соответствии с национальными60рекомендациями [121] [табл.

6, диаграмма 4].Таблица 6.Изменение спектра грибов рода Candida, выделенных от ВИЧинфицированных пациентов после 2х недельной терапии флуконазолом.До лечения%После лечения%C.albicans56,39,1C.glabrata43,881,8C.tropicalis00C.krusei09,1В т.ч.43,890,9C.non-albicans61Диаграмма 4. Изменение спектра грибов рода Candida, выделенных от ВИЧинфицированных пациентов после 2х недельной терапии флуконазолом.Анализ динамики видового состава грибов рода Candida в ходе леченияпоказал его существенное изменение: отмечено сокращение пула C. albicans в 6,18раз (p <0,05), увеличение доли C. glabrata в 1,87 раз (p <0,05), а также появление вединичном случае C. krusei.Подтверждено генетическое различие штаммов albicans и glabrata,выявленных методом методом ПЦР до и после антимикотической терапии.Полученные нами различные штамы были обозначены нами как штаммы 1, 2, 3, 4.Среднее количество изолятов, полученных от одного пациента, в общемсоставило 1,29.

При этом в процессе лечения этот показатель возрос с 1,14 до1,57, т.е. увеличился на 37,7%.При анализе полученных данных установлено наличие изменений в62гетерогенностиассоциацийгрибовродаCandida,выделенныхуВИЧ-инфицированных пациентов, после 2х недельной терапии флуконазолом. [табл. 7,диаграмма 5].Таблица 7.Изменение архитектуры сообщества грибов рода Candida ВИЧинфицированных пациентов после 2-х недельной терапии флуконазолом (в %).ЧислокомпонентовДо леченияПосле лечения176,971,4223,114,33004014,323,128,6ассоциацииВсего % грибов вассоциациях63Диаграмма 5.

Изменение архитектуры сообщества грибов рода CandidaВИЧ-инфицированных пациентов после 2-х недельной терапии флуконазолом (в%).Анализ динамики архитектуры сообщества грибов рода Candida в процесселечения выявил следующие различия: так в 76,9% случаев до и 71,4% послелечения они встречались как единичный вид, в 23,1-28,6% – как ассоциация видов[табл. 7]. Однако, если до лечения двухкомпонентные ассоциации грибов родаCandida встречались у 23,1% пациентов, то после лечения их доля снизилась до14,3%, т.е. в 1,6 раза. При этом наибольшую долю среди ассоциаций составлялибинарные.Интересен факт появления после лечения четырехкомпонентнойассоциации.Особый интерес представлял анализ компонентов, образующих ассоциациюгрибов рода Candida после 2-х недельной терапии флуконазолом (в %) [табл.