Диссертация (Клинико-биохимические маркеры минерализации осевого скелета и костного метаболизма у подростков с хроническим гастритом), страница 8

Биохимическое исследование маркеров минерального обмена включало всебя определение в сыворотке крови уровня Са++, уровня Р+, уровня активностиОЩФ. В оценку костного обмена нами были включены основные метаболическиемаркеры, такие как ОК, СКТ и ПТГ. Содержание 25(OН)D (Витамин D2 и витаминD3) в сыворотке крови определяли методом ИФА (25(OН)D ELISA -EIA-5396),используя набор фирмы DRG.Комплексное обследование подростков с гастроэнтерологическими жалобамисостояло из эндоскопического метода - ФГДС, морфологического исследованиябиоптатов СО тела и антрального отделов желудка, обнаружение НР - с помощьюуреазного теста (Helpil–test) и прибором Хеликосенс.

При условии совпадения39положительных результатов трех методов идентификации НР (гистологическогометода, данных прибора Хеликосенс и Helpil–test), нами был диагностированхеликобактериозитакиеподросткивключалисьвисследование.НРотрицательный статус устанавливался в случае если во всех используемыхметодах результат был отрицательный. Пациенты с НР-неопределенным статусомв исследование не вошли.У подростков без гастроэнтерологических жалоб отрицательный НР -статусопределяли по данным неинвазивного исследования прибором Хеликосенс.ДлядиагностикиНМПКиспользовалиметодикудвухэнергетическойрентгеновской абсорбциометрии поясничного отдела позвоночника (L1-L4) наденситометре Hologic QDR 4500C, оснащенном педиатрической референтной базой.40Дизайн исследования представлен на рисунке 3.1 этап: Отбор групп исследования, критерии включения и исключенияКлинический осмотр: гастроэнтеролог, ортопед,стоматолог, педиатр, неинвазивный тест ХеликосенсПодростки с болями в животеСтандартное гастроэнтерологическое обследование:ФГДС, морфологическое исследование биоптатовслизистой оболочки желудка (СОЖ), идентификацииHelicobacter pylori - посредством уреазного теста(Helpil–test) и прибором ХеликосенсПодростки без болей в животе сотрицательным НР статусомn=19128 подростковс морфологически верифицированным диагнозомхронический гастритНР+ХГНР-ХГn= 86n=422этап: исследование костной системы и ее метаболизмаЛабораторные: определение биохимических маркеров костного метаболизма: уровеньионизированного кальция, фосфора, ОЩФ, ОК, продуктов деградации коллагена I типа- СКТ(71 исследование).25(OН)D (Витамин D2 и витамин D3) в сыворотке крови определяли методом ИФА (25(OН)DELISA -EIA-5396), используя набор фирмы DRG (39 исследований).Инструментальные: двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия поясничного отделапозвоночника L1-L4 на денситометре Hologic QDR 4500C, оснащенный педиатрическойреферентной базой (71 исследование).412.2.

Методы клинического, лабораторного и инструментальногообследования подростков2.2.1. Общеклиническое обследованиеОбследование подростков с ХГ проводилось на клинических отделениях:отделение КДЦ для детей №2 СПб ГУЗ "Городская поликлиника №23" ипедиатрическихотделенияхгосударственного№1бюджетногои№2Ленинградскогоучрежденияобластногоздравоохранения«Детскаяклиническая больница» г.

Санкт-Петербурга. Нами использовались такие методы,как сбор анамнеза и жалоб, антропометрия с расчетом ИМТ и оценкойфизического развития по центильным таблицам, общеклинический осмотр, анализкрови, анализ мочи, анализ кала на определение яиц глистов, копрограмма,исследование функциональных проб печени, ультразвуковое исследованиеоргановбрюшнойполости.Порезультатам,полученнымвходеобщеклинического исследования мы осуществляли отбор пациентов длядальнейшего углубленного исследования.2.2.2. Гастроэнтерологическое обследованиеДля постановки и подтверждения диагноза ХГ мы использовали два метода:эндоскопический- ФГДС, и морфологическое исследование биоптатов слизистойоболочки антрального и фундального отделов желудка [23, 214].ФГДСпроводиласьпообщепринятойметодике.Исследованиеосуществляли эндоскописты: И.А.

Шац (КДЦ для детей №2 СПб ГУЗ "Городскаяполиклиника №23"), Т.М. Григорян (заведующая отделением эндоскопииЛОГБУЗ «ДКБ» г.Санкт-Петербурга, врач высшей категории по эндоскопии, врачвысшейкатегориипогастроэнтерологии,главныйвнештатныйдетскийгастроэнтеролог Комитета Здравоохранения Ленинградской области), и В.А.Калашникова, на аппарате «Olympus» (Япония) типа GIF Q 30 [9, 117].

Пациентам42ФГДС проводили без премедикации. Эндоскопические варианты ХГ выделялись всоответствии с Сиднейской системой [23].При эндоскопическом исследовании были взяты материалы из СОантрального отдела желудка (забор произведен по большой кривизне на 2 см отпривратника), СО фундального отдела желудка (биоптат взят по передней стенкев средней трети).

Все биоптаты обязательно маркировались. Материал из СО телаи антрального отдела желудка после проведения Helpil–test (тест–билеты фирмы«Sintana SM») отправляли в патологоанатомическое отделение ГБ№4 длягистологического исследования.Морфологическоеизучениебиоптатовпроводилосьзаведующейпатологоанатомическим отделением ГБ№4 к.м.н. С.В. Азанчевской.Биоптат фиксировался в 10% нейтральном забуференном раствореформалина в течение суток.

Затем подготавливали парафиновые срезы, толщинакоторых составляла 4-5мкм. Использовали окраски гемотоксилином и эозином,пикрофуксином, окраску по методу Ван Гизона (необходимо для определениявыраженности фиброза); кроме того, окрашивали альциановым синим при рН 1,0(для определения наличия метаплазии), и проводили окраску по методуРомановского-Гимзы (для определения НР). Оценка материала проводилась постандартной визуально – аналоговой шкале [10]. Кроме этого, в срезах из СО телажелудка мы проводили оценку наличия очаговой деструкции желез.

Как известно,очаговая деструкция желез слизистой оболочки тела желудка является одним изморфологических критериев аутоиммунного гастрита у детей [9, 142].Также в препаратах мы оценивали степень отека слизистой оболочкижелудка (СОЖ), выраженность фиброза, гиперсекреции слизи, определялиналичие кровоизлияний и микротромбозов, определяли лимфоидные фолликулы.Приоценкематериаламыпользовалисьединымпротоколомгистологического исследования (см. приложение №1).Для определения НР в биоптате мы использовали окрашивание по методуРомановского-Гимзы.

Для оценки числа микробных тел НР применяласьметодика Л.И. Аруина с соавторами [8, 9, 10].43Кроме того, обнаружение HP проводилось посредствам Helpil–test иприбора Хеликосенс.Доказано, что НР вырабатывает фермент уреазу, которая способнанакапливаться в ткани желудка, что делает возможным обнаружить ее вбиоптатах СО желудка. На этом принципе основан метод Helpil–test.В своем исследовании мы использовали Helpil–test производства ООО«Sintana SM» [214]. Основу теста составил твердый пористый гигроскопическийволокнистый носитель, который содержит карбамид в количестве 0,2–0,5 г/дм2,индикатор бромтимоловый синий с рН перехода от 6,0 до 7,6 в количестве 1–20мг/дм2 и представлен тест–билетами.

Чтобы оценить уреазную активность,биоптат помещали на тест–билет и в течение трех минут регистрировалиизменение цвета индикатора – появление синего пятна на желтом фоне. В томслучае, когда синее пятно появлялось до 1 минуты, уровень инфицированностиНР был высокий (НР «+++»), если синее пятно появлялось через 1 до трех минут– уровень инфицированности НР был умеренный (НР «+»).

По истечении трехминут оценка окраски не проводилась. Тест не нарушает структуру исследуемогоматериала, что дает возможность использовать биоптат в дальнейшем длягистоморфологического исследования.Нами применялся неинвазивный метод исследования прибором Хеликосенс,для подтверждения НР статуса пациентов с ХГ и без гастроэнтерологическихжалоб.Исследование проводилось с помощью газоанализатора выдыхаемоговоздуха, «HelicoSense Routine» («HS»).

Этот экспресс метод определенияпоказателей инфицированности пациента бактерией НР, основан на определенииаммиака в выдыхаемом воздухе пациента после нагрузки карбамидом. Оценкарезультатов производится в относительных единицах (ПИ), и отображается надисплее. Результат «неинфицированный НР» – при < 1, «сомнительныйрезультат» - при 1,1, «инфицирован НР» - при > 1[48, 214].44Изучение кислотообразующей функции желудка проводилась методомгастроимпедансометрии, с помощью прибора «Реогастрограф РГГ-01».Полученные показатели оценивались согласно рекомендациям Ф.Н. Рябчуки соавт.

(2001) по среднеарифметическим значениям низкочастотного импеданса изфундальной области. Нормацидному состоянию натощак соответствовалипоказатели интрагастрального импеданса в диапазоне от 30 до 45 0м, чтосоставляет18-22 ммоль/лэквНСL,гиперацидномусостоянию-средняяконцентрация HCL более 22 ммоль/лэкв, гипоацидному состоянию - менее 18ммоль/лэкв HCL. В базальную фазу: нормоцидное состояние желудкарегистрировалось при значения импеданса 23-34 Ом в фундальной области илипри пересчете в кислотность - 22-32 ммоль/лэкв HCL, повышенная кислотность выше 32 ммоль/лэкв HCL, пониженная - менее 22 ммоль/лэкв HCL.2.2.3.

Методы изучения костного метаболизмаК маркерам минерального метаболизма относятся: Са++, Р+, активностьОЩФ, к маркерам костного метаболизма в сыворотке крови относят: ОК, СКТ иПТГ. Определение данных маркеров мы проводили в клинико-биохимическойлаборатории Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования Санкт-Петербургского государственногомедицинского педиатрического университета.Уровень Са++и Р+ в плазме крови определялся на аппарате Микролит"Конелаб", Финляндия, с помощью ионоселективных электродов.

Нормальнымипоказателями содержания Са++ в плазме крови у подростков (12-17 лет) считалисьследующие значения: 1,03– 1,23 ммоль/л, Р+- 1,1- 1,8 ммоль/л [278].Определение уровня ОЩФ в плазме крови проводилось кинетическимколориметрическим методом, по рекомендации DGKC c ДЭА буфером.45Нормальными показателями содержания ОЩФ в плазме крови у подростков (1217 лет) считались следующие значения: 50- 644 Ед/л [278].Определениемаркеровкостногометаболизма(ОК,СКТ,ПТГ)осуществлялось при помощи иммунноэлектро-хемилюминисцентного способа.Известно, что ОК является наиболее важным неколлагеновым белкомкостного матрикса и синтезируется исключительно остеобластами [164].