Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 6

В результате, последующее очищение белка методом аффинной хроматографии будет простым и быстрым. Часто маркер сам по себе является антигеннойдетерминантой, или эпитопом, который может быть узнан высоко специфичнымантителом. Антитело затем может быть использовано как для локализации белкав клетке, так и для его очистки (рис. 8.15). Другие типы маркеров специальноконструируют для очистки белков. Например, аминокислота цистеин связываетопределенные ионы металлов, включая никель и медь. Если использовать методыгенной инженерии для прикрепления к концу белка короткой цепочки гистидинов,то такой слегка модифицированный белок можно селективно задержать на аффинной колонке, содержащей ионы никеля.

Таким образом, аффинную хроматографиюс  использованием металлов можно применять для очистки модифицированногобелка из сложной смеси молекул.В качестве маркера узнавания также используют целый белок. Клетки можно модифицировать таким образом, чтобы они на одном конце интересующегобелка синтезировали маленький фермент глутатион-S-трансферазу (GlutathioneS-Transferase, GST).

Получившийся химерный белок может быть очищен от остальных компонентов клетки при помощи аффинной колонки, содержащей глутатион  — молекулу субстрата, специфически и прочно связывающую GST. Еслипроводить очистку в условиях, не мешающих белок-белковым взаимодействиям,то химерный белок может быть изолирован вместе со взаимодействующими с нимв клетке белками (рис.

8.16).914Часть III. МетодыРис. 8.14. Очищение белков методом хроматографии. Типичные результаты, полученные после последовательного использования трех типов хроматографии для очистки белка. В данном примере гомогенатклеток сначала был фракционирован путем пропускания через ионообменную смолу в колонке (а).Колонку промыли для удаления всех несвязанных загрязнителей, а связанные белки элюировали путемпропускания через колонку раствора, содержащего постепенно увеличивающуюся концентрацию соли.Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле напрямую прошли через колонку и были собранысамыми первыми. Оставшиеся белки были элюированы последовательно в зависимости от их сродствак смоле — для удаления белков с наибольшим сродством потребовалась наибольшая концентрациясоли.

Интересующий белок был элюирован в несколько фракций и обнаружен по его ферментативнойактивности. Фракции, в которых наблюдалась активность, были объединены и пропущены через вторую,гель-фильтрационную колонку (б). Наличие в элюате все еще не очищенного белка вновь определилиза  счет ферментативной активности. Положительные фракции собрали и очистили до гомогенногосостояния на аффинной колонке (в), содержавшей иммобилизованный субстрат фермента. (г) Анализаффинной очистки циклин-связывающих белков из S.

cerevisiae при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, описанного ниже на рисунке 8.18. Дорожка 1 — общий экстрактклетки; дорожка 2 — белки, элюированные из аффинной колонки, содержавшей циклин B2; дорожка3 — один основной белок, элюированный из аффинной колонки, содержавшей циклин B3. Белки дорожек 2 и 3 элюированы из аффинной колонки при помощи соли; гель окрашен Кумасси. Шкала слевапоказывает молекулярный вес белков-маркеров в кДа.

(г, из D. Kellog et al., J. Cell Biol. 130: 675–685, 1995.С любезного разрешения издательства The Rockefeller University Press.)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 915Рис. 8.15. Маркирование эпитопом для локализации или очистки белков. При помощи стандартныхметодов генной инженерии к интересующему белку может быть присоединен короткий пептидныймаркер. Если маркер сам по себе является антигенной детерминантой, или эпитопом, для него легкобудет найти коммерчески доступное антитело. Соответствующим образом меченое антитело можноиспользовать для определения местонахождениябелка в клетке или для очистки его аффинной илиоснованной на иммунной преципитации хроматографией.

В случае иммунной преципитации в раствор, содержащий маркированный белок, добавляют направленные против эпитопного маркераантитела; антитела специфически поперечно связывают маркированные молекулы белка и осаждают их в форме комплексов антитело-белок.Для дальнейшего улучшения методов очистки при помощи маркеров узнавания между нужным белком и маркеромможно вставить аминокислотную последовательность, представляющую собой сайт расщепления для высоко специфичногопротеолитического фермента.

Характерные для сайтов расщепления последовательности аминокислот редко случайно встречаются в белках, поэтому метку будет легкоудалить без разрушения очищенного фермента.Такой тип специфического расщепления используют в очень эффективном методеочистки, известном как тандемная аффинная очистка (Tandem Affinity Purificationtagging, tap-tagging). При этом один конец белка модифицируют таким образом,чтобы он содержал два маркера узнавания, разделенных сайтом расщепления протеазой.

Маркер на самом конце химерного белка должен необратимо связыватьсяс аффинной колонкой, что позволяет полностью отмыть колонку от всех загрязняющихбелков. Расщепление протеазой затем освобождает белок, который далее очищают,используя второй маркер. Поскольку такой двухэтапный подход дает особенно высокую степень очистки белка при относительно небольшой затрате усилий, его широкоприменяют в клеточной биологии.

Например, для очистки любого дрожжевого белкаэтим методом сконструировали набор из приблизительно 6 000 штаммов дрожжей,каждый со своим индивидуальным кодирующим маркер геном, пришитым к ДНК.8.2.6.  Очищенные бесклеточные системы необходимы для точногоопределения функций молекулВажно изучать биологические процессы независимо от сложных побочных реакций, происходящих в живой клетке с помощью очищенных бесклеточных систем.Для этого гомогенаты клеток фракционируют с целью очистки каждой отдельноймакромолекулы, необходимой для катализа интересующего биологического процесса. Например, эксперименты по расшифровке механизмов синтеза белка начиналис  клеточного гомогената, в  котором транслировались РНК. Фракционированиеэтого гомогената шаг за шагом дало рибосомы, тРНК и различные ферменты, кото-916Часть III.

МетодыРис. 8.16. Очистка белковых комплексов при помощи химерного белка, маркированного GST. Содержащие GST химерные белки, синтезируемыев генетически модифицированных клетках, можнозадержать на аффинной колонке, заполненной покрытыми глутатионом гранулами. Не связавшиесяс гранулами белки будут вымыты из колонки. Химерный белок вместе с другими крепко связаннымис ним клеточными белками можно элюировать глутатионом. Эти дополнительные белки можно идентифицировать при помощи масс-спектрометрии(смотри рис.

8.21). Аффинные колонки также могутсодержать антитела против GST или другие подходящие маленькие белки, или эпитопные маркеры(см. рис. 8.15).рые все вместе образуют систему синтезабелка. Как только отдельные очищенныекомпоненты стали доступны, их можнобыло по отдельности добавлять или удалять. Это позволило точно определитьроль каждого компонента от начала доконца процесса.Реконструкция каждого биологического процесса в очищенной бесклеточной системе — одна из ключевых задачклеточной биологии. Только так можноопределить все необходимые для данного процесса компоненты и контролировать ихконцентрации, что очень важно для понимания механизма их действия. Предстоитеще много работы, но значительная часть того, что мы сегодня знаем о молекулярнойбиологии, получена благодаря изучению бесклеточных систем.

Их использовали,например, для расшифровки деталей репликации и транскрипции ДНК, сплайсингаРНК, трансляции белков, сокращения мышц и транспорта частиц вдоль микротрубочек, а также множества других происходящих в клетке процессов.ЗаключениеБиохимический анализ клеточных популяций путем их разрушения и фракционирования их содержимого позволил создавать функциональные бесклеточныесистемы.

Эти системы высокой степени очистки необходимы для определениядеталей сложных клеточных процессов на молекулярном уровне. Для этого требуется очистка белков и других участвующих в интересующем процессе компонентов. Белки в растворимом клеточном экстракте можно очистить методамиколоночной хроматографии; тип матрицы колонки определяет, по какому признаку будут разделяться биологически активные белки: по молекулярной массе,гидрофобности, распределению заряда или сродству к другим молекулам.

Обычнопри очистке белок поочередно пропускают через несколько колонок — полученныев одной колонке обогащенные фракции помещают в следующую. Метод рекомбинантных ДНК, который будет описан ниже, позволяет прикреплять к белкамспециальные маркеры узнавания, что значительно упрощает очистку.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 9178.3.  Анализ белковБелки участвуют в большинстве процессов в клетке: они катализируют метаболические реакции, гидролизуют нуклеотиды для совершения механической работыи служат главным структурным элементом клетки. Огромное разнообразие структурыи функций белков стало причиной разработки множества методов их анализа.8.3.1.  Белки можно разделить при помощи электрофореза  в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)Обычно белки несут суммарный положительный или отрицательный заряд,определяемый составляющими их заряженными аминокислотными остатками.