Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 9

Обычно проводят два независимых измерения. Сначала измеряют скоростьосаждения комплекса в поле центробежных сил, созданном ультрацентрифугой (см.рис. 8.11, а). Полученная в результате константа седиментации (или величина S)зависит как от размера, так и от формы комплекса и сама по себе не дает полезнойинформации.

Однако после проведения второго гидродинамического измерения —построения графика движения комплекса через колонку для гель-хроматографии(см. рис. 8.13, б) — можно рассчитать приблизительную форму комплекса и егомолекулярную массу.Молекулярную массу также можно оценить проще при помощи аналитическойцентрифуги, сложного прибора, позволяющего производить измерения поглощениябелка, когда образец подвергается действию центробежных сил. При этом подходеобразец центрифугируют до тех пор, пока он не достигнет состояния равновесия,Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 925при котором действующая на белковый комплекс центробежная сила точно уравновесит диффузию комплекса. Точка равновесия зависит от молекулярной массыкомплекса, но не от его формы, поэтому метод позволяет напрямую рассчитатьмолекулярную массу для определения стехиометрии каждого белка в белковомкомплексе.8.3.6.  Группы взаимодействующих белков можно идентифицировать при помощи биохимических методовПоскольку большинство белков в клетке функционируют в составе комплексов с другими белками, для характеристики биологической роли неизвестногобелка важно сначала идентифицировать все белки, с которыми он специфическисвязывается.Коиммунопреципитация является одним из методов идентификации прочносвязывающихся друг с другом белков.

В данном случае антитело узнает специфический белок-мишень; затем связанные с антителом и прикрепленные к твердойматрице химические соединения вытягивают комплекс из раствора и на дно пробирки. Если во время образования комплекса с антителом исходный белок-мишеньдостаточно прочно связан с другим белком, то его партнер также будет преципитирован. Этот метод полезен для идентификации входящих в комплексы внутриклетки белков, включая тех, которые взаимодействуют с другими молекуламитолько временно, например, когда внеклеточные сигнальные молекулы стимулируютклетку (см.

обсуждение в главе 15). Другим часто используемым методом идентификации белков-партнеров является аффинная хроматография (см. рис. 8.13, в).Модификация этого метода для обнаружения взаимодействующих белков состоитв том, что интересующий белок прикрепляется к полимерным гранулам колонки.Когда белки в клеточном экстракте промываются при прохождении через колонку, те белки, которые взаимодействуют с интересующим белком, задерживаютсяаффинной матрицей. Затем их можно элюировать и идентифицировать с помощьюмасс-спектрометрии.В дополнение к фиксации белковых комплексов на колонках или в пробиркахдля изучения белковых взаимодействий исследователи разрабатывают высокоплотные белковые чипы.

Эти биочипы, содержащие тысячи различных белков или антител, нанесенных на стеклянную подложку или иммобилизованных в очень маленькихлунках, позволяют исследовать биохимическую активность и профили связыванияодновременно большого количества белков. Например, если инкубировать флуоресцентно меченый белок с биочипами, содержащими тысячи иммобилизованныхбелков, пятна, которые сохранят способность к флуоресценции после отмывания,будут содержать белок, с которым исходный белок специфически связывается.8.3.7.  Белок-белковые взаимодействия также можно идентифицировать методом дрожжевой двугибридной системыДо настоящего момента мы делали упор на биохимические подходы к изучениюбелок-белковых взаимодействий.

Однако один из наиболее эффективных методов — двугибридные системы — основан на применении внутренних клеточныхмеханизмов для обнаружения белок-белковых взаимодействий.Метод использует модульную природу белков-активаторов генов (см. рис. 7.45).Эти белки связываются со специфической последовательностью ДНК и активируют926Часть III. Методытранскрипцию гена, причем эти функции обычно выполняют различные домены белка.

При помощи метода рекомбинантных ДНК два таких белковых домена используютдля создания отдельных химерных белков — «наживки» и «добычи». Для конструирования белка-«наживки» последовательность ДНК, кодирующую интересующийбелок, сшивают с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен белка-активаторагена. Когда такую конструкцию вводят в дрожжи, клетки начинают синтезироватьхимерный белок, состоящий из интересующего белка и ДНК-связывающего домена(рис. 8.24). Этот белок связывается с регуляторным участком репортерного гена,где служит в качестве «наживки» для ловли белков, взаимодействующих с интересующим белком. Для поиска потенциальных белков-партнеров (потенциальной«добычи» на «наживку») возможные кандидаты также должны представлять собойхимерные белки: ДНК, кодирующая активирующий домен белка-активатора гена,сшивается с большим количеством различных генов.

Отдельные гены из этого набора,кодирующие потенциальную «добычу», поодиночке вводят в клетки дрожжей, содержащие «наживку». Если дрожжевая клетка получает клон ДНК, экспрессирующийбелок-«добычу» для белка-«наживки», то две половинки активатора транскрипциисоединяются и включают ген-репортер (см. рис. 8.24).Этот остроумный метод кажется сложным, но двугибридные системы относительно легко применять в лаборатории. Несмотря на то что белок-белковые взаимодействия происходят в ядре дрожжевой клетки, так можно исследовать белкииз любой части клетки и любого организма.

Cозданы двойные гибридные системы,позволяющие создать схему взаимодействий между всеми белками, синтезирующимися в организме. В данном случае для каждого белка конструируются химерныебелки «наживки» и «добычи», что позволяет наблюдать любую комбинацию этихбелков. При помощи этого метода созданы карты взаимодействий большинствабелков дрожжей, круглого червя C. elegans и мушки Drosophila.8.3.8.  Объединение полученных разными методами данных даетнадежные карты белковых взаимодействийКак показано в главе 3, подробные карты белковых взаимодействий могутбыть очень полезны для определения функций белков (см. рис. 3.82).

Поэтомуметод двойных гибридов и описанный выше биохимический метод, известныйкак тандемная аффинная очистка (см. стр. 515–516), были автоматизированыдля определения тысяч взаимодействующих белков. К сожалению, различныеэксперименты приводят к разным результатам, и многие обнаруженные в однойлаборатории взаимодействия не обнаруживают в другой. Таким образом, наиболее надежные карты белковых взаимодействий включают в себя данные многихэкспериментов, то есть каждое отмеченное на карте взаимодействие подтвержденоболее чем одним методом.8.3.9.  Оптические методы позволяют наблюдать белковые взаимодействия в реальном времениКак только стало известно, что два белка (или белок и малая молекула) связываются, возникла необходимость более подробно охарактеризовать их взаимодействие.

Белки могут связываться друг с другом на более-менее продолжительноевремя (например, как субъединицы РНК-полимеразы или протеосомы) или всегона несколько миллисекунд (как киназа и ее субстрат).Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 927Для понимания механизма функционирования белка в клетке необходимоопределить, насколько крепко он связывается с другими белками, как быстро онот них диссоциирует, и как ковалентные модификации, малые молекулы или другиебелки влияют на эти взаимодействия. Такого рода исследования динамики белковчасто требуют использования оптических методов.Определенные аминокислоты (например, триптофан) обладают слабой флуоресценцией, которую можно обнаружить при помощи чувствительных флуориметров.Часто интенсивность флуоресценции, или спектр испускания, флуоресцирующихаминокислот, расположенных в области контакта двух белков, изменяется при связывании этих белков. Когда такое изменение может быть зафиксировано при помощифлуориметрии, становится возможным получить точное количественное описаниепроцесса связывания белков.Особенно полезным методом исследования динамики связывания белковс другими молекулами является поверхностный плазмонный резонанс (SLR).

Этотметод позволяет охарактеризовать широкий спектр молекулярных взаимодействий,включая связывание антигена с антителом, лиганда с рецептором, белков с ДНК,углеводами, малыми молекулами и другими белками.SLR регистрирует связывание молекул путем слежения за отражением лучасвета от границы раздела между водным раствором потенциально связывающихсямолекул и поверхностью биодатчика, несущего иммобилизованный белок-«наживку».Интересующий белок прикреплен к очень тонкому слою металла, нанесенногоРис. 8.24. Дрожжевые двойные гибридные системы для обнаружения белок-белковых взаимодействий.

Интересующий белок сшивают с ДНК-связывающим доменом, направляющим химерныйбелок к регуляторной области репортерного гена в качестве «наживки». Когда в ядре клетки этот белоксвязывается с другим специально сконструированным белком («добычей»), их взаимодействие приводит к объединению двух половинок активатора транскрипции, который затем запускает экспрессиюгена-репортера.928Часть III. Методына одну сторону стеклянной призмы (рис. 8.25). Луч света пропускают через призму;под определенным углом, называемым резонансным, энергия света взаимодействует с электронным облаком металлической пленки, что приводит к возникновениюплазмона – колебания электронов перпендикулярно плоскости пленки.

Электроны«прыгают» вверх и вниз между верхней и нижней поверхностями пленки, как грузна пружинке. Плазмон, в свою очередь, сверху и снизу металлической поверхностисоздает электрическое поле, распространяющееся на очень короткое расстояние —порядка длины волны света. Любое изменение состава среды в пределах электрического поля приведет к измеряемому изменению резонансного угла.Для исследования связывания раствор белков (или других молекул), которые потенциально взаимодействуют с иммобилизованным белком-«наживкой»,пропускают мимо поверхности биодатчика. Белки, связывающиеся с наживкой,изменяют состав молекулярных комплексов на металлической поверхности, чтоприводит к изменению резонансного угла (см.