Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 10

рис. 8.25). Изменение резонансногоугла происходит в реальном времени и отражает кинетику связывания/диссоциации молекул с интересующим белком. Константу связывания kon измеряют по меревзаимодействия молекул, а константу распада комплексов koff определяют по меретого, как буфер отмывает связанные молекулы с поверхности датчика. Константаравновесия рассчитывается путем деления koff на kon. Помимо измерения кинетики,LPR можно использовать для определения числа молекул в комплексе: интенсивность сигнала изменяется пропорционально массе иммобилизованного комплекса.Метод LPR особенно эффективен, поскольку он требует малых количеств белка, нет необходимости метить белок и взаимодействие белка с другими молекуламиможно наблюдать в реальном времени.В третьем оптическом методе исследования белковых взаимодействий используется зеленый флуоресцентный белок GFP (см.

ниже) и его производныеразличной окраски. В этом подходе два интересующих белка метят различнымифлуорохромами таким образом, чтобы спектр испускания одного флуорохромаперекрывался со спектром поглощения другого. Если два белка и прикрепленныек ним метки сближаются на очень короткое расстояние (в пределах 1–10 нм), тоэнергия поглощенного света передается от одного флуорохрома другому.

Передачу энергии, носящую название резонансного переноса энергии флуоресценции(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), регистрируют путем освещенияпервого флуорохрома и измерения испускания второго (рис.  8.26). Этот методособенно эффективен в сочетании с флуоресцентной микроскопией, поскольку онпозволяет характеризовать белок-белковые взаимодействия в определенных областях живой клетки.8.3.10.  Некоторые методы позволяют следить за одиночнымимолекуламиВышеописанные биохимические методы применяют для изучения большихпопуляций молекул. Это ограничение отражает малые размеры биологическихмолекул по отношению к чувствительности методов их обнаружения. Однакопоследние разработки высокочувствительных и точных измерительных методовпривели к возникновению новой ветви биофизики — исследованию одиночныхмолекул.

Изучение отдельных молекул особенно важно для клеточной биологии,потому что в основе многих процессов лежит функционирование нескольких критических молекул в клетке.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 929Рис. 8.25. Поверхностный плазмонный резонанс. (а) Метод обнаруживает взаимодействия, контролируя отражение луча света от границы раздела между водным раствором потенциально связывающихсямолекул (показаны зеленым) и поверхностью биодатчика, на которую нанесен иммобилизованныйбелок-«наживка» (показан красным).

(б) Раствору белков-«добычи» разрешено обтекание иммобилизованного белка-«наживки». Связывание молекул-«добычи» с белками-«наживкой», а также распадкомплекса при их отмывании буферным раствором, приводит к регистрируемому изменению резонансного угла. Эти изменения, наблюдаемые в реальном времени, отражают образование и распадмолекулярных комплексов.930Часть III. МетодыРис. 8.26.

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Чтобы определить взаимодействие двухбелков в живой клетке, их сначала синтезируют в виде химер совместно с зеленым флуоресцентным белком(GFP) или его производными другого света. (а) В данном примере белок X сшит с голубым флуоресцентнымбелком (tagCFP), который возбуждается фиолетовым светом (370–440 нм) и испускает синий свет (440–480нм); белок Y сшит с зеленым флуоресцентным белком, который возбуждается синим светом и испускаетзеленый (510 нм). (б) Если белки X и Y не взаимодействуют, при освещении образца фиолетовым светомбудет наблюдаться флуоресценция только голубого флуоресцентного белка. (в) При взаимодействии белковX и Y может произойти резонансный перенос энергии флуоресценции. Освещение образца фиолетовымсветом возбуждает синий флуоресцентный белок, его испускание, в свою очередь, возбуждает зеленыйфлуоресцентный белок, что приводит к испусканию зеленого света.

Флуорохромы должны быть близко расположены (на расстоянии около 1–10 нм), чтобы произошел перенос энергии. Поскольку не все молекулыбелков X и Y связаны постоянно, можно наблюдать некое голубое свечение. Но как только белки начинаютвзаимодействовать, испускание донора GFP падает, а испускание акцептора GFP растет.Первый пример исследования функции одиночной молекулы белка — использование контактного прижимного электрода для измерения прохождения электрического тока через единственный ионный канал (см. рис.

11.33). Другой подход состоитв прикреплении белка к более крупной структуре, например грануле полистирола,которую затем можно наблюдать при помощи обычной микроскопии. Этот подходдал особенно полезные результаты при измерении движения моторных белков.К грануле, например, можно прикрепить молекулы двигательного белка кинезина(см. главу 16). В результате, наблюдая движение связанной с кинезином гранулывдоль микротрубочки, можно измерить величину шага мотора (то есть расстояние,пройденное за счет гидролиза одной молекулы ATP). Как мы увидим в главе 9,оптические микроскопы обладают ограниченным разрешением за счет дифракциисвета, но для определения положения гранулы с гораздо большей точностью, чемпозволяет разрешение микроскопа, можно сочетать вычислительные и оптическиеметоды. При помощи такого подхода можно легко обнаруживать и количественноописывать очень малые движения — порядка нанометров.Глава 8.

Манипуляция белками, ДНК и РНК 931Еще одно достоинство прикрепления молекул к более крупным гранулам — этигранулы могут служить «рычагами», с помощью которых становится возможнымманипулировать молекулами. Это позволяет прилагать к молекулам силы и наблюдать их ответ. Например, скорость или величину шага мотора можно измерить какфункцию силы, против которой он работает. В следующей главе описано как можноиспользовать сфокусированный лазерный луч в качестве «оптического пинцета» дляприложения к грануле механической силы и исследования белков под действиемвнешних сил (см.

рис. 9.35). На гранулы также можно воздействовать магнитнымисилами; этот метод носит название «магнитного пинцета». Если в магнитном поленаходится множество гранул, на них всех будет действовать одинаковая сила, чтопозволяет параллельно, в течение одного эксперимента управлять большим количеством гранул.Гранулы можно использовать в качестве маркеров для слежения за движением белков, но, очевидно, предпочтительнее визуализировать белки сами по себе.В следующей главе мы увидим, что недавние достижения микроскопии сделалиэто возможным.8.3.11.  Функционирование белков можно селективно нарушитьпри помощи малых молекулХимические ингибиторы внесли значительный вклад в развитие клеточнойбиологии.

Например, для анализа того, какие микротрубочки участвуют в данномбиологическом процессе, часто используют ингибитор микротрубочек колхицин;несколько десятилетий назад эта молекула способствовала первому выделениюи очистке тубулина. В прошлом такого рода небольшие молекулы обычно имелиприродное происхождение, то есть они синтезировались живыми организмами. Несмотря на то что, в целом, природные вещества были невероятно полезны для наукии медицины (см., например, таблицу 6.4, стр. 385), они влияли на ограниченноечисло биологических процессов.

Однако недавнее развитие методов синтеза сотентысяч малых молекул и автоматического широкомасштабного скрининга обещаетидентификацию ингибиторов практически всех биологических процессов. В такогорода подходах большие наборы малых химических соединений анализируются одновременно как в живой клетке, так и в бесклеточных системах. Как только ингибиторобнаруживается, его можно использовать в качестве зонда для идентификациибелка, с которым он связывается. Для этого используют аффинную хроматографию(см.

рисунок 8.13, в) и другие сходные методы. Такой подход, часто называемыйхимической биологией, позволил обнаружить ингибиторы многих ключевых белков,принимающих участие в процессах клеточной биологии. При помощи этого метода,например, идентифицирован белок кинезин, участвующий в митозе (рис. 8.27).Химические ингибиторы дают клеточным биологам возможность контролироватьвремя ингибирования, поскольку лекарства можно быстро добавлять или удалятьиз клеток, обеспечивая быстрое включение и выключение функции белка.8.3.12.  Структуру белка можно установить при помощи рентгеноструктурного анализаОсновной метод расшифровки трехмерной структуры молекул, включая белки,в атомном разрешении — рентгеновская кристаллография.