Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 8

Полученную информацию затем используют для поиска по геномным базамданных, в которых содержатся массы всех белков и их предполагаемых пептидныхфрагментов, полученные из последовательности генома организма (рис. 8.21, а).Однозначное совпадение с определенной открытой рамкой считывания можно получить, зная массу лишь нескольких пептидов, входящих в состав данного белка.MALDI-TOF позволяет получить точную молекулярную массу белков и пептидов. Более того, используя одновременно два масс-спектрометра (такое сочетаниеносит название МС/МС), можно напрямую определить аминокислотную последовательность отдельных пептидов в сложной смеси. Как описано выше, образец белкасначала расщепляют на пептиды меньшего размера, затем разделяют при помощиГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 921Рис.

8.21. Использование масс-спектрометрии для идентификации белков и секвенирования пептидов.Выделенный белок расщепляют трипсином, и пептидные фрагменты помещают в масс-спектрометр.Далее для идентификации белка можно использовать два подхода. (а) В первом методе массы пептидовопределяют напрямую при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF. Затем поиском по базам данныхнаходят ген, кодирующий белок, чей расчетный профиль расщепления трипсином совпадает с полученными значениями. (б) Масс-спектрометрия также позволяет напрямую определить аминокислотнуюпоследовательность пептидных фрагментов. В данном примере триптические пептиды сначала разделяют в масс-спектрометре в зависимости от массы.

Затем каждый пептид еще больше фрагментируется,в основном путем расщепления пептидных связей. В результате получается вложенное множествопептидов, различающихся по размеру на одну аминокислоту. Эти фрагменты помещают во второй сопряженный масс-спектрометр и определяют их массу. Разность масс двух близко связанных пептидовможно использовать для определения «лишней» аминокислоты. Посредством последовательногоповторения этой процедуры можно определить частичную аминокислотную последовательность исходного белка. Для наглядности показан анализ образца из одного очищенного белка. На самом деле,масс-спектрометрию обычно применяют для смеси белков, полученных, например, для аффиннойхроматографии (см.

рис. 8.16), это позволяет идентифицировать все присутствующие в смеси молекулы.Более того, масс-спектрометрия способна также определять посттрансляционные модификации белков,как описано в тексте.922Часть III. Методымасс-спектрометрии. Каждый пептид затем фрагментируется еще больше за счет столкновения с высокоэнергетическими атомами газа. Этот метод фрагментации в основномнаправлен на разрушение пептидных связей, что приводит к образованию «лестницы»фрагментов, отличающихся на одну аминокислоту. Во втором масс-спектрометре этифрагменты разделяют и определяют их массу. Анализируя эти различия в массах,можно восстановить аминокислотную последовательность пептида (рис.

8.21, б).МС/МС очень полезна для нахождения и определения точного положенияпосттрансляционнных модификаций белков, например фосфорилирования или ацетилирования. Поскольку эти модификации приводят к характерному увеличению массыаминокислоты, их легко детектировать при помощи масс-спектрометрии. В главе 3мы говорили, что протеомика — термин, объединяющий множество различных экспериментальных методов, — представляет собой описание всех белков клетки, включаявсе белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации.

В сочетаниис быстрыми методами очистки, описанными в предыдущем разделе, масс-спектрометриястала наиболее могущественным методом нахождения посттрансляционных модификаций как данного белка, так и всех белков, связанных с ним в процессе очистки.8.3.4.  Двумерные методы разделения исключительно эффективныРазные белки могут обладать одинаковым размером, формой, массой и суммарным зарядом, поэтому большинство методов разделения, таких как гель-электрофорезв полиакриламидном геле или ионообменная хроматография, обычно неспособныобнаружить все белки клетки или хотя бы органеллы.

В отличие от этих методов,двумерный гель-электрофорез, в котором использованы два различных подходак разделению белков, обладает разрешением в 2 000 белков (это общее число различных белков в простой бактерии) на двумерной карте белков.На первом шаге белки разделяют по их характерному заряду. Образец растворяют в маленьком объеме раствора неионного (незаряженного) детергента, содержащего также β-меркаптоэтанол и денатурирующее химическое соединение —мочевину. В этом растворе все пептидные цепи денатурируют и диссоциируют, но ихсобственный заряд при этом не меняется.

Полипептидные цепи затем разделяютв градиенте pH при помощи метода изоэлектрического фокусирования, основанногона изменении суммарного заряда молекулы белка в зависимости от pH окружающегораствора. Каждый белок имеет характерную изоэлектрическую точку, то есть pH,при котором он не несет суммарного заряда и, следовательно, не движется в электрическом поле.

При изоэлектрическом фокусировании белки электрофоретическиразделяют в узкой трубке полиакриламидного геля, в котором при помощи смесиспециальных буферных растворов задают pH. Каждый белок движется в градиенте до места, соответствующего его изоэлектрической точке, и останавливается там(рис. 8.22). Это первое пространственное измерение двумерного электрофорезав полиакриламидном геле.На втором шаге узкий гель, содержащий разделенные белки, вновь подвергаютэлектрофорезу, но в перпендикулярном относительно первого шага направлении.В этот раз добавляют ДСН, и белки разделяют в соответствии с их размером, какв одномерном ДСН-ПААГ; исходный узкий гель вымачивают в ДСН и помещаютна край пластины полиакриламидного геля с ДСН, через который будут мигрироватьполипептидные цепи.

В результате каждый белок будет формировать отдельноепятно. Это второе пространственное измерение двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Не разделяются лишь белки, имеющие как одинаковый заряд,Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 923Рис. 8.22. Разделение молекул белков методом изоэлектрического фокусирования. При низком pH(высокой концентрации H+) карбоксильные кислотные группы белков не заряжены (–COOH), а их содержащие азот основные группы заряжены полностью (например, –NH3+). В результате большинствобелков в таких условиях будут нести положительный суммарный заряд. При высоком pH карбоксильныекислотные группы заряжены отрицательно (–COO–), а основные группы не заряжены (например, –NH2),поэтому большинство белков несут отрицательный заряд. При изоэлектрическом pH белок не имеетсуммарного заряда, поскольку положительные и отрицательные заряды находятся в равновесии.

Такимобразом, когда трубка, содержащая фиксированный градиент pH, подвергается воздействию сильногоэлектрического поля в подходящем направлении, каждый тип белков в образце будет двигаться до техпор, пока он не сформирует четкую полосу в своей изоэлектрической точке, как показано на рисунке.так и одинаковую массу, но это редкий случай. При помощи радиоавтографии,если на белок сначала пометили радиоизотоп, или различных методов окрашивания можно обнаружить даже следовые количества каждой полипептидной цепи(рис. 8.23). Метод обладает очень хорошим разрешением, позволяющим отличитьбелки, различающиеся на одну заряженную аминокислоту.В настоящее время доступен другой, еще более могущественный «двумерный»метод, направленный на определение всех белков, содержащихся в органелле илидругой сложной смеси белков. Поскольку метод основан на масс-спектрометрии, онподходит для белков, выделенных из организмов с полностью расшифрованнымгеномом.

Сначала присутствующие в смеси белки расщепляют трипсином, что даетболее короткие пептиды. Затем эти пептиды автоматизированно разделяют несколькими последовательными шагами жидкостной хроматографии. В качестве второгопространственного измерения каждый пептид помещают напрямую в  тандемныймасс-спектрометр (MS/MS), позволяющий определить его аминокислотную последовательность и любые посттрансляционные модификации. Такой метод, в которомтандемный масс-спектрометр (MS/MS) соединен с выходным отверстием автоматической системы для жидкостной хроматографии (LC), называют LC-MS/MS. Сейчасанализ образца целой органеллы и идентификация сотен белков и их модификацийпри  помощи LC-MS/MS стали уже рутинной процедурой. Конечно, невозможноидеально изолировать органеллу, и некоторые из обнаруженных белков будут «загрязняющими».

Их часто можно исключить путем анализа соседних фракций, полученныхпри очищении органелл, и «вычитания» их из максимума фракции органеллы.924Часть III. МетодыРис. 8.23. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле. В этом геле разделены все белки бактериальной клетки E. coli. Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белкиразделяли методом изоэлектрического фокусирования в соответствии с их изоэлектрическими точкамив направлении слева направо. Дальнейшее фракционирование проводили в соответствии с их молекулярной массой при помощи электрофореза сверху вниз в присутствии ДСН.

Заметим, что различныебелки присутствовали в различных количествах. Бактерии выращивали в культуре, содержащей меченныерадиоизотопами аминокислоты, поэтому все белки были радиоактивны, и их можно было обнаружитьпри помощи радиоавтографии (см. стр. 602–603). (С любезного разрешения Patrick O’Farrell.)8.3.5.  Гидродинамические измерения позволяют установитьразмер и форму белковых комплексовБольшинство белков в клетке функционируют в составе комплексов, и знанияо размере и форме этих комплексов часто указывает на их функцию. Существуетнесколько важных способов получения такой информации. Комплекс иногда можнонапрямую визуализировать при помощи электронной микроскопии, как описанов главе 9. Дополнительно к этому существует подход, основанный на гидродинамических свойствах комплексов, то есть на их поведении при движении в жидкойсреде.