Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF))

Часть IIIМетодыГлавы:8. Манипуляция белками, ДНК и РНК9. Визуализация клеток8Манипуляция белками,ДНК И РНКПрогресс науки зачастую тесно связан с развитием технологий. Например,целая область клеточной биологии возникла, когда ремесленники научились шлифовать маленькие линзы настолько высококачественно, что стало возможнымнаблюдать за клетками и их внутренней структурой. Развитие методов шлифовкилинз, а не концептуальные или философские успехи, позволили Гуку и Левенгукуоткрыть ранее невиданный клеточный мир, где в маленькой капле воды копошатсякрошечные создания (рис. 8.1).XXI век обещает быть особенно успешным для клеточной биологии.

Активное применение новых методов анализа белков, ДНК и РНК приводит к информационному взрыву. Сейчас ученые могут исследовать клетки и макромолекулыранее невообразимыми способами. Нам доступны последовательности миллиардовнуклеотидов, и, как следствие, полные молекулярные схемы сотен организмов —от микробов и арабидопсиса до червей, мух, мышей, собак, шимпанзе и людей.Эффективные новые методы помогают интерпретировать эту информацию, позволяянам не только составлять огромные подробные каталоги генов и белков, но и начатьпонимать механизмы слаженной работы этих компонентов, обеспечивающей существование и функционирование клеток и организмов.

Долгосрочная цель заключаетсяни много ни мало в достижении полного понимания того, что происходит в клеткепри ее взаимодействии с окружающей средой и соседями. Мы хотим знать, какиеработают гены, какие транскрипты мРНК присутствуют в клетке и какие белкиРис. 8.1. Микроскопическая жизнь. Примеры «разнообразных анималькул», увиденных Левенгукомпри помощи его простейшего микроскопа. (а) Бактерия из зубного налета. Изображенные на рис. (B)организмы Левенгук охарактеризовал как «плавающие сначала вперед, а потом назад» (1692). (б) Эукариотическая зеленая водоросль Volvox (1700). (С любезного разрешения фонда John Innes.)894Часть III.

Методыактивны: где они расположены, с какими другими молекулами они связываютсяи к каким метаболическим путям или сетям они принадлежат. Мы также хотимзнать, как клетка успешно управляется с таким ошеломляюще большим количеством переменных и как она выбирает из практически неограниченного количествавозможностей те, которые позволяют ей выполнять разнообразные биологическиезадачи. Такого рода информация позволит нам сформулировать фундаментальныепринципы и со временем предсказывать, как гены и белки функционируют, чтобызаложить основы жизни.В данной главе мы опишем некоторые принципиальные методы исследованиямолекулярных компонентов клетки, а именно белков, ДНК и РНК.

Мы рассмотрим,как выделять из тканей клетки различных типов, как их выращивать вне организмаи как разрушать клетки и получать составляющие их органеллы и макромолекулыв чистом виде. Мы также расскажем о новейших методах изучения структуры,функций и взаимодействий белков и рассмотрим прорывы в  ДНК-технологии,продолжающие переворачивать наше понимание клеточных функций.Описанные в данной главе методы позволили совершить множество открытий,представленных в данной книге, и в настоящее время ими ежедневно пользуютсядесятки тысяч ученых.8.1.  Выделение и выращивание клеток в культуреНесмотря на то что органеллы и большие молекулы в клетке можно увидетьпри помощи микроскопа, чтобы понять, как они работают, необходим детальныйбиохимический анализ.

Большинство биохимических методов требует физическогоразрушения большого количества клеток для получения доступа к их компонентам. Если в качестве пробы берется образец ткани, состоящий из различных типовклеток, неоднородные клеточные популяции будут смешаны между собой. Чтобыполучить как можно больше информации о клетках ткани, биологи разработалиспособы выделения клеток из ткани и разделения их по типам.

Эти приемы позволяют получить относительно однородные популяции клеток, которые можно ужеанализировать либо напрямую, либо после значительного увеличения их количестваза счет пролиферации в культуре.8.1.1.  Клетки можно выделить из интактных тканейИнтактные ткани представляют собой наиболее приближенный к реальнойживой системе источник материала, так как они дают клетки, на самом деле присутствующие в организме. Первый шаг выделения отдельных клеток — разрушение внеклеточного матрикса и межклеточных контактов, связывающих клетки.Образец ткани обычно обрабатывают протеолитическими ферментами (например,трипсином и коллагеназой), переваривающими белки внеклеточного матрикса,и хелатообразующими агентами (такими как этилендиаминтетрауксусная кислота,или ЭДТА), которые связывают ионы Ca2+, опосредующие межклеточные контакты.

Такая ткань затем может быть разрушена при помощи мягкого механическоговстряхивания.В некоторых методах биохимического анализа нужный белок можно в достаточном количестве получить без разделения ткани на отдельные типы клеток.Например, это справедливо для приготовления гистонов из тимуса телят, актинамышц кролика или тубулина коровьего мозга.

В других случаях получение не-Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 895Рис. 8.2. Клеточный сортер с возбуждением флуоресценции. Изменяют флуоресценцию проходящейчерез лазерный луч клетки. Капельки, содержащие единственную клетку, заряжаются положительноили отрицательно в зависимости от того, обладает ли клетка флуоресценцией. Затем они в соответствиис зарядом направляются за счет электрического поля в пробирку для сбора образцов.

Отметим, что необходимо подобрать концентрацию клеток таким образом, чтобы большинство капель не содержалоклеток и уходило в контейнер для отходов вместе с любыми клеточными агрегатами.обходимого белка требует его накопления в клетках определенного типа. Чтобывыделить отдельные типы клеток из смешанной суспензии, применяют несколькоподходов.

Наиболее распространенный способ разделения основан на меченииспецифических клеток при помощи флуоресцентного красителя, связанного с антителом. Антитело подбирают таким образом, чтобы оно специфически связывалосьтолько с поверхностью одного типа клеток ткани. Меченые клетки затем можноотделить от немеченых при помощи электронного клеточного сортера с возбуждением флуоресценции. В этом удивительном приборе отдельные клетки поодиночкепроходят мимо лазерного луча, быстро измеряющего флуоресценцию каждойклетки. Вибрационный распылитель создает крошечные капельки, содержащиеединственную клетку или не содержащие клеток вовсе. Содержащие клетку капли896Часть III.

Методыв момент образования автоматически получают положительный или отрицательныйзаряд в зависимости от того, обладает ли клетка флуоресценцией; затем они за счетсильного электрического поля направляются в соответствующий контейнер. Редкиескопления клеток, которые обнаруживаются за счет повышенного светорассеяния ихповерхности, остаются незаряженными и отправляются в контейнер отходов.

Такиеприборы способны эффективно выделить одну флуоресцирующую клетку из 1 000немеченых и отсортировать несколько тысяч клеток за секунду (рис. 8.2).Некоторые клетки также можно получить при помощи аккуратного препарирования тонких тканевых срезов, приготовленных для микроскопическогоисследования (см. глава 9). В одном из подходов на кусочек ткани накладываюттонкую пластиковую пленку и облучают направленным импульсом инфракрасноголазера. Такой импульс расплавляет маленьких кружок пленки, связывая расположенные ниже клетки, которые затем можно отделить для дальнейшего анализа.Этот метод, называющийся лазерной захватывающей микродиссекцией, можноприменять для выделения и анализа клеток из различных областей опухоли, чтопозволяет сравнивать их свойства и молекулярный состав со свойствами соседнихнормальных клеток.

В подобном методе импульс лазера напрямую вырезает группуклеток и катапультирует их в соответствующий контейнер для дальнейшего анализа(рис. 8.3).Рис. 8.3. Метод микродиссекции для выделения клеток из тканевых срезов. Лазерный луч использовандля вырезания интересующего участка ткани и его выталкивания в контейнер. Этот подход позволяетвыделить даже единичные клетки из образца ткани.Полученная любым из этих или каким-либо другим методом выделения однородная популяция клеток может быть напрямую использована для биохимическогоанализа. После разрушения клеток при помощи механического воздействия, детергентов или других процедур можно выделить цитоплазму или индивидуальныеорганеллы, а затем очистить специфические молекулы.8.1.2.  Клетки можно выращивать в культуреМолекулы можно выделять из целых тканей, но часто это не самый удобныйисточник материала, требующий, например, поездок на бойню с утра пораньше.Проблема состоит не только в удобстве.

На используемом в качестве источникаГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 897органов скоте невозможно проводить генетические манипуляции. Более того, сложность интактных тканей и органов является неотъемлемым недостатком при очисткеотдельных молекул. Выращенные в культуре клетки представляют собой болееоднородную популяцию для извлечения материала, к тому же с ними гораздо удобнее работать в лаборатории. В подходящих условиях в чашке Петри большинстворастительных и животных клеток может расти, делиться и даже дифференцироваться. Клетки можно непрерывно исследовать под микроскопом или анализироватьих биохимическими методами.

Кроме того, на них можно систематически изучатьвлияние добавления или удаления специфических молекул, например гормоновили факторов роста. Более того, при смешивании двух типов клеток возможноисследовать взаимодействие одного типа с другим.Иногда эксперименты с культурами клеток называют экспериментами in vitro(буквально — «в стекле»), в противовес работе с интактными живыми организмами,к которой применяют термин in vivo (буквально — «в живом организме»). Этиназвания иногда приводят к путанице, потому что зачастую биохимики вкладываютв них совершенно другой смысл. В биохимической лаборатории термин in vitroотносится к экспериментам, проводимым в пробирке без живых клеток, тогда какin vivo относится к любой реакции, протекающей внутри живой клетки, даже еслиэта клетка растет в культуре.Культивирование тканей началось в 1907 г.