Часть 3 (1129751), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Методыдаже маленькие макромолекулы, например молекулы тРНК и простые ферменты,седиментировать с ощутимой скоростью, и, таким образом, их можно отделитьдруг от друга по размеру.Ультрацентрифуги также используют для разделения клеточных компонентовв зависимости от их плавучей плотности, вне зависимости от размера и формы.В этом случае образец седиментируют через большой градиент плотности, содержащий высокие концентрации сахарозы или хлорида цезия.
Каждый клеточныйкомпонент начинает движение против градиента (см. рис. 8.11, а), но в конце концовон достигнет положения, в котором плотность раствора будет равна его собственной плотности. После этого компонент будет плавать на поверхности и не сможетдвигаться дальше. Таким образом, в центрифужной пробирке образуется наборотдельных полос, из которых наиболее близкие ко дну будут обладать наибольшейплавучей плотностью (рис. 8.11, б).
Так называемый метод седиментационногоравновесия настолько чувствителен, что позволяет отделять макромолекулы, содержащие тяжелые изотопы, например 13C или 15N, от таких же макромолекул,содержащих более легкие, распространенные изотопы (12C или 14N). На самом делеметод с использованием градиента хлорида цезия разработали в 1957 г. для разделения меченой и немеченой ДНК после добавления в среду к растущим популяциям бактерий предшественников нуклеотидов, содержащих 15N; этот классическийэксперимент предоставил прямые доказательства полуконсервативной репликацииДНК (см. рис.
5.5).8.2.2. Клеточные экстракты представляют собой доступныесистемы для изучения клеточных функцийИзучение выделенных в центрифуге органелл и других крупных субклеточныхкомпонентов внесло неоценимый вклад в наше понимание функций различныхклеточных компонентов. Эксперименты на очищенных при помощи центрифугирования митохондриях и хлоропластах, например, оказали центральную функциюэтих органелл — преобразование энергии в формы, доступные для использованияклетками. Точно так же замкнутые везикулы, образовавшиеся из фрагментовшероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума (микросомы), были отделены друг от друга и проанализированы в качестве моделей этих компартментовв интактной клетке.Концентрированные клеточные экстракты, в частности экстракты ооцитов Xenopus laevis (африканской шпорцевой лягушки), сыграли главную роль в изучениитаких сложных и высокоорганизованных процессов, как цикл клеточного деления,расхождение хромосом при помощи веретена деления и везикулярный транспортпри движении белков из эндоплазматического ретикулума через аппарат Гольджив плазматическую мембрану.По сути, клеточные экстракты представляют собой исходный материал для полного разделения всех отдельных макромолекулярных компонентов клетки.
Теперьмы рассмотрим, как достигается такое разделение, сосредоточив свое вниманиена белках.8.2.3. Белки можно разделить при помощи хроматографииЧаще всего белки разделяют при помощи колоночной хроматографии, при этомсмесь растворенных белков пропускают через колонку, содержащую твердую пори-Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 911стую матрицу (сорбент). Различные белки по-разному взаимодействуют с сорбентоми задерживаются на матрице, их можно будет собрать отдельно по мере выходаиз колонки (рис. 8.12). В зависимости от выбора матрицы белки можно разделитьпо заряду (ионообменная), гидрофобности (гидрофобная), способности связыватьопределенный вид малых молекул или макромолекул (аффинная хроматография)и размеру (гель-хроматография или гель-фильтрация).Многие виды сорбентов доступны коммерчески (рис.
8.13). Ионообменныеколонки заполнены маленькими гранулами, несущими либо положительный, либоотрицательный заряд, поэтому белки разделяются на них в зависимости от распределения зарядов на поверхности. Гидрофобные колонки заполнены гранулами, из которых выходят гидрофобные боковые цепи, селективно удерживающиерасположенные на поверхности белков гидрофобные области. Колонки для гельфильтрации, в которых происходит разделение белков в зависимости от размера,содержат мельчайшие пористые гранулы: молекулы, которые достаточно малыдля того, чтобы проникать в поры, дольше задерживаются в колонке, тогда каккрупные молекулы остаются в растворе, омывающем сорбент, и, таким образом,движутся быстрее и первыми выходят из колонки. Помимо разделения молекул,гель-фильтрация служит удобным способом определения их размера.Неоднородности сорбентов (например, целлюлоза), приводящие к неравномерному потоку растворителя через колонку, ограничивают разрешение обычныхметодов колоночной хроматографии.
Специальные смолы для хроматографии(обычно, на основе силикагеля), состоящие из мельчайших сфер (3–10 мкм в диа-Рис. 8.12. Разделение молекул методом колончатой хроматографии. Образец — раствор, содержащийсмесь различных молекул, — наносят на цилиндрическую стеклянную или пластиковую колонку, содержащую проницаемую твердую матрицу, например целлюлозу. Затем через колонку медленно прокачивают большой объем растворителя и собирают его в разные пробирки по мере выхода. Посколькуразличные компоненты движутся по колонке с разными скоростями, они будут разделены по разнымпробиркам.912Часть III. МетодыРис.
8.13. Три типа используемых в хроматографии сорбентов. (а) В ионообменной хроматографии нерастворимый сорбент несет ионные заряды, задерживающиедвижение несущих противоположный заряд молекул.В качестве сорбентов для разделения белков используютположительно заряженную диэтиламиноэтилцеллюлозу(ДЭАЭ-целлюлозу) и отрицательно заряженные карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу) и фосфоцеллюлозу.Также часто используют аналоги, основанные на агарозеили других полимерах. Сила связывания растворенныхмолекул с ионообменной матрицей зависит от ионнойсилы и pH проходящего через колонку раствора. Такимобразом, для достижения эффективного разделенияих можно систематически изменять (как на рис.
8.14).(б) При гель-фильтрации сорбент инертен, но содержитпоры. Молекулы, которые достаточно малы для того,чтобы проникать в поры, задерживаются в них и, таким образом, движутся по колонке медленнее, чемкрупные молекулы, не способные входить в поры сорбента. Доступен широкий ассортимент гранул поперечно сшитых полисахаридов (декстрана, агарозы или акриламида) с разными размерами пор, чтопозволяет использовать их для разделения молекул различной молекулярной массы — от менее чем500 Да до более чем 5 × 106 Да. (в) В аффинной хроматографии применяется нерастворимый сорбент,ковалентно связанный со специфическим лигандом, например молекулой антитела или субстратомфермента, которые будут связывать определенный белок.
Молекулы фермента, связавшиеся в такихколонках с неподвижным субстратом, можно элюировать (извлечь из адсорбента) при помощи концентрированного раствора субстрата в свободной форме. Молекулы, связавшиеся с неподвижнымиантителами, можно элюировать путем диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированнымраствором соли или раствором с высоким или низким pH. Аффинная хроматография позволяет достичьвысокого уровня разделения однократным пропусканием раствора через колонку.метре), могут быть равномерно упакованы в колонку при помощи специального прибора.
Такая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяетдостичь высокого уровня разрешения. В ВЭЖХ элюент (растворенное вещество)очень быстро приходит в равновесие с внутренним содержимым гранул сорбента, и,следовательно, молекулы с разным сродством к сорбенту эффективно разделяютсядаже при высоких скоростях потока. ВЭЖХ служит основным методом очисткимногих белков и малых молекул.Глава 8.
Манипуляция белками, ДНК и РНК 9138.2.4. В основе аффинной хроматографии лежит использованиеспецифических сайтов связывания белковЕсли начинать со сложной смеси белков, описанные выше типы колоночнойхроматографии не дадут очень чистых фракций: однократное пропускание раствора через колонку обычно увеличивает долю белка в смеси не больше чем в 20 раз.Поскольку большинство отдельных белков составляют лишь 1/1 000 от общегобелка клетки, для достижения достаточной степени очистки обычно приходитсяпоследовательно использовать несколько различных типов колонок (рис.
8.14).Более эффективный метод, известный как аффинная хроматография, основанна использовании биологически важных процессов связывания, происходящихна поверхности белков. Если молекула субстрата коваленто связана с инертной матрицей, например полисахаридными гранулами, фермент, преобразующий данныйсубстрат, будет специфически удерживаться на сорбенте. Затем его можно элюировать (вымыть) в практически чистом виде. Точно так же можно иммобилизоватькороткие олигонуклеотиды ДНК со специально разработанной последовательностьюдля очистки ДНК-связывающих белков, которые в норме узнают данную последовательность нуклеотидов в хромосоме (см.
рис. 7.28). В качестве альтернативыможно поместить на матрицу специфические антитела и очистить молекулы белков,узнаваемых этими антителами. В таких колонках, благодаря их высокой специфичности, при однократном пропускании смеси можно достичь увеличения доли белкав растворе в 1 000–10 000 раз.8.2.5. Маркеры, сконструированные методами генетическойинженерии, лежат в основе простого способа очистки белковПри помощи описанных ниже методов рекомбинантных ДНК можно модифицировать любой ген так, чтобы его белок синтезировался со специальным маркеромузнавания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
