Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 7

Наложение электрического поля на содержащий белковую молекулу раствор заставляет белок двигаться со скоростью, зависящей от его суммарного заряда, размераи формы. Это свойство используют, проводя электрофорез в полиакриламидномгеле (ПААГ) в присутствии ДСН (ДСН-ПААГ). Обогащенный поперечнымисшивками полиакриламидный гель используют в качестве инертной матрицы,через которую движутся белки. Гель приготавливают путем полимеризации мономеров; размер пор можно произвольно выбрать таким образом, чтобы они былидостаточно малы для замедления движения определенных молекул. Сами белкипомещают не в простой водный раствор, а в раствор, содержащий сильный отрицательно заряженный детергент — додецилсульфат натрия, ДСН (рис.

8.17). Этотдетергент связывается с гидрофобными областями белков, что приводит к разрывусвязей белковых молекул друг с другом илимолекулами липидов. В результате каждая молекула белка в растворе детергента находитсяв свободном растворенном состоянии. Помимоэтого, для разрыва S–S связей в белках обычнодобавляют восстанавливающий агент, напримерβ-меркаптоэтанол. Это позволяет анализировать отдельные пептиды, входящие в составмультисубъединичных белков.Что происходит, когда смесь растворенных в ДСН белков пропускают через слойполиакриламидного геля? Каждая молекуласвязывает большое количество отрицательнозаряженных молекул детергента, что маскирует собственный заряд белка и заставляетего двигаться к положительному электродупри наложении разницы потенциалов.

Белкиодинакового размера будут двигаться через гельс одинаковой скоростью, так как, во-первых,Рис. 8.17. Детергент додецилсульфат натрия (ДСН) и восстанавливающий агент β-меркаптоэтанол. Эти два соединения используют для солюбилизации белков с помощьюэлектрофореза в полиакриламидном геле в присутствииДСН. Здесь изображена его ионизированная форма.918Часть III. Методыони были полностью развернуты при  помощи ДСН, и, следовательно, имеютодинаковую форму и, во-вторых, они связали одинаковое количество ДСН и,следовательно, несут одинаковый отрицательный заряд.

На более крупные белкис большим зарядом будут действовать большие электрические силы, и они будутсильнее тормозиться. В простом растворе эти два эффекта исключили бы другдруга, но в сетке полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито,большие молекулы будут задерживаться в значительно большей степени, чем малые.В результате сложная смесь белков разделяется на отдельные полосы белков, расположенные в зависимости от молекулярной массы молекулы (рис. 8.18). Содержащиеся в большом количестве белки легко зарегистрировать путем окрашивания ихв геле, например, раствором Кумасси (бриллиантовый синий).

Даже содержащиесяв малом количестве белки можно увидеть в геле, если добавить серебряный илизолотой краситель. Минимальное количество белка, которое можно определитьв полосе, составляет 10 нг.ДСН-ПААГ широко применяют, так как он позволяет разделить любые типыбелков, включая те, которые в нормальных условиях в воде нерастворимы, на-Рис. 8.18. Электрофорез в полиакриламидномгеле в присутствии ДСН (ДСН-ПААГ).

а) Ячейкадля электрофореза. б) Отдельные полипептидные цепи образуют комплекс с отрицательнозаряженными молекулами додецилсульфатанатрия (ДСН) и, таким образом, движутся черезпористый полиакриламидный гель в  формекомплекса ДСН-белок. Поскольку скоростьдвижения при таких условиях будет тем больше, чем меньше белок, этот метод может бытьиспользован для оценки молекулярной массыполипептидной цепи и субъединичного состава белков.

Однако, если белок содержитбольшое количество углеводов, его движениебудет аномальным, и полученная при помощиДСН-ПААГ примерная молекулярной масса будет неправильной.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 919пример мембранные белки. Поскольку полипептиды разделяются по размеру,метод позволяет судить о молекулярной массе и субъединичном составе белков.На рис. 8.19 представлена фотография геля, использованного для анализа каждогоэтапа очистки белка.8.3.2.  Специфические белки можно обнаружить путем гибридизации с антителамиОпределенный белок можно идентифицировать после фракционирования в ПААГпутем экспонирования всех присутствующих в геле белков к специфическому антителу, связанному с радиоактивным изотопом, легко регистрируемым ферментом илифлуоресцентным красителем. Для удобства все разделенные белки, находящиесяв геле, сначала переносят (путем «промокания», отсюда английский термин «блоттинг») на нитроцеллюлозную бумагу или нейлоновую мембрану.

После помещениямембраны на гель налагают сильное электрическое поле, которое заставляет белкивыходить из геля и переходить на мембрану. Затем мембрану вымачивают в растворемеченого антитела, что позволяет обнаружить нужный белок. Этот метод обнаружениябелков называется вестерн-блоттинг, или иммуноблоттинг (рис. 8.20).8.3.3.  Масс-спектрометрия является высокочувствительным методом идентификации неизвестных белковКлеточные биологи и биохимики часто сталкиваются с задачей идентификацииодного или нескольких белков, полученных одним из ранее описанных методовочистки (см., например, рис.

8.16). Поскольку геномы наиболее распространенныхэкспериментальных организмов расшифрованы, существуют каталоги всех синтезируемых в этих организмах белков. Это упрощает задачу идентификации неизвестногобелка (или набора неизвестных белков), так как теперь необходимо лишь сравнитьнекоторые из содержащихся в образце аминокислотных последовательностей с известными генами. В настоящее время дляэтого практически повсеместно применяютмасс-спектрометрию в сочетании с  компьютерным поиском по базам данных.Рис. 8.19. Анализ белковых проб при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН.На фотографии изображен окрашенный Кумасси гель,использованный для обнаружения белков на различныхстадиях очистки фермента.

Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную смесь белков из исходного клеточного экстракта. Каждая следующая дорожкапоказывает белки, полученные после хроматографического фракционирования белковой пробы, проанализированной на предыдущей дорожке (см. рис. 8.14).На старт над каждой дорожкой помещали одинаковоеколичество белка (10 мкг). Отдельные белки обычно выглядят как четкие окрашенные полосы, однако полосаможет уширяться, если она содержит слишком многобелка. (Из T. Formosa and B. M. Alberts, J. Biol.

Chem. 261:6107–6118, 1986.)920Часть III. МетодыРис. 8.20. Вестерн-блоттинг. Все белки из делящихся клеток табака в культуре сначала разделяютпри помощи двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (метод описан на рисунке 8.23).На (а) положение белков определено при помощи чувствительного белкового красителя. На (б) разделенные в одинаковом геле белки перенесены на лист нитроцеллюлозы и экспонированы к антителу,специфичному к белкам, фосфорилированным во время митоза по остаткам треонина. Положениепорядка дюжины белков, с которыми связалось данное антитело, определяют при помощи связанногос ферментом второго антитела. Этот метод также иногда называют иммуноблоттингом (или вестернблоттингом). (Из J. A. Traas et al., Plant J.

2: 723-732, 1992. С любезного разрешения Blackwell Publishing.)Динамика заряженных частиц под действием электрического и магнитногополей в вакууме подчиняется строгим законам. Этот принцип используют в массспектрометрии для разделения ионов в зависимости от отношения их массы к заряду.Это невероятно чувствительный метод. Для него требуется очень малое количествовещества, и он позволяет определять точную массу интактных белков и пептидов,полученных путем ферментативного или химического расщепления. Полученныемассы очень точны; часто ошибка меньше чем одна миллионная. Наиболее распространенный вид данного метода — это матричноактивированная лазернаядесорбция/ионизация с времяпролетным масс-анализатором (MALDI-TOF).При этом подходе содержащиеся в образце белки сначала расщепляют до короткихпептидов.

Эти пептиды затем смешивают с органической кислотой и высушиваютна металлической или керамической подложке. Затем образец облучают лазером,и пептиды покидают подложку в виде ионизированного газа, в котором каждаямолекула несет один или более положительных зарядов. Ионизированные пептиды ускоряются в электрическом поле и  летят в  сторону детектора. Их массаи заряд определяют время, за которое они достигнут детектора: большие пептидыдвижутся медленнее, а частицы с большим зарядом — быстрее. Анализируя такиеионизированные пептиды, несущие единственный заряд, можно определить точнуюмассу содержащихся в исходном образце пептидов. MALDI-TOF также можно использовать для точного определения массы интактных белков массой до 200 тысячкДа.