Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 2

с эксперимента, направленногона разрешение спора между нейробиологами, чтобы проверить гипотезу, носящуюназвание «нейронной доктрины». Ее смысл заключается в том, что каждое нервноеволокно представляет собой отросток единственной нервной клетки, а не результатслияния нескольких клеток. Чтобы проверить это утверждение, маленькие кусочкиспинного мозга поместили в свернувшуюся тканевую жидкость и поставили в теплую влажную камеру. Через равные интервалы времени препарат наблюдали подмикроскопом. Примерно через день отдельные нервные клетки начали выпускатьв тромбы длинные тонкие волокна (аксоны). Таким образом, нейронная доктринаполучила широкую поддержку и заложила фундамент для революции в молекулярной биологии, произошедшей в результате разработки метода культивированияклеток.В этих первых экспериментах на нервных волокнах использовали маленькиефрагменты тканей, называемые эксплантатами.

Сейчас культуры чаще выращиваютиз суспензии клеток, выделенных из тканей при помощи описанных выше методов.В отличие от бактерий, большинство клеток ткани не способно жить в толще жидкости, для роста и деления им требуется твердая поверхность. В случае клеточныхкультур такой подложкой служит поверхность пластиковой культуральной чашкиПетри.

Однако различным типам клеток нужны различные условия, и многимклеткам для пролиферации или дифференциации необходимо наличие в чашкеПетри вещества, к которому они могли бы прикрепиться, например полилизинаили компонентов внеклеточного матрикса.Культуры, приготовленные напрямую из клеток организма, называют первичными культурами. На начальном этапе их можно фракционировать, то естьразделить по типам клеток, но так делают не всегда. В большинстве случаев,клетки первичной культуры можно извлекать из культуральной чашки и повторно выращивать, получая так называемые вторичные культуры; таким образом,их можно многократно пересевать (пассировать) в течение недель или месяцев.Такие клетки обладают множеством признаков, характерных для их источника898Часть III.

Методы(рис. 8.4): фибробласты продолжают секретировать коллаген; клетки, выделенныеиз эмбриональных скелетных мышц, сливаются с образованием мышечных волокон,способных к спонтанному сокращению в культуральной чашке; из нервных клетоквырастают аксоны, обладающие электрической возбудимостью и образующие синапсы с другими нервными клетками; эпителиальные клетки формируют плоскиеслои, свойства которых во многом совпадают со свойствами интактного эпителия.Сохранение такого рода характерных черт в культуре позволяет исследовать клеткиметодами, которые часто недоступны в случае интактных тканей.В клеточных культурах выращивают не только животные клетки.

Когдафрагмент растительной ткани культивируют в стерильной среде, содержащей минеральные вещества и соответствующие регуляторы роста, многие клетки начинаютнеограниченно пролифелировать, образуя беспорядочную массу относительно недифференцированных клеток – каллюс. При осторожном подборе минеральныхвеществ и регуляторов роста можно вызвать формирование в каллюсе апикальных меристем сначала побегов, а затем корней, и воссоздать целое растение. Каки в случае животных клеток, каллюсные культуры можно механически разделитьна отдельные клетки, которые будут расти и делиться в суспензионной культуре(см.

рис. 8.4 , г).8.1.3.  Эукариотические клетки широко используют в качествеисточника однородных клетокС клеточными культурами, полученными путем разрушения тканей, связанаодна проблема – со временем клетки умирают. Большинство клеток позвоночныхперестают делиться после конечного числа делений в культуре. Этот процесс на-Рис. 8.4. Микрофотографии клеточных культур.

(а) Фибробласты мыши. (б) Куриные миобласты, сливающиеся с образованиеммногоядерных мышечных клеток. (в) Очищенные нервные клеткиганглия сетчатки крысы. (г) Клетки табака в жидкой культуре. (С любезного разрешения Daniel Zicha (а); Rosalind Zalin (б); издательстваElsevier из A. Meyer-Franke et al., Neuron 15: 805-819, 1995 (в) и GethinRoberts (г).)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 899зывается репликативным старением клеток (подробно этот вопрос обсуждаетсяв главе 17). Нормальные фибробласты человека, например, в культуре обычноделятся только 25–40 раз.

В таких клетках ограниченная способность к пролиферации отражает постепенное укорочение теломер — расположенных на концаххромосом последовательностей ДНК с большим количеством повторов и специальными белками (см. главу 5). Соматические клетки человека отключили синтезфермента теломеразы, за счет которой поддерживается постоянная длина теломер,и поэтому теломеры укорачиваются с каждым делением. Человеческие фибробласты можно уговорить пролифелировать бесконечно, введя в них ген, кодирующийкаталитическую субъединицу теломеразы; в этом случае их можно размножатьв качестве «бессмертной» клеточной линии.Однако некоторые клетки человека нельзя обессмертить таким способом.Несмотря на то что их теломеры остаются длинными, они все равно прекращаютделиться после ограниченного числа делений, так как условия культивированияв конце концов запускают механизм контрольных точек клеточного цикла (см.главу 17), который останавливает клеточный цикл, – этот процесс иногда называюткультуральным шоком.

Чтобы эти клетки не прекращали делиться, недостаточноодного введения теломеразы. Необходимо также инактивировать механизм контрольных точек. Это можно сделать путем введения определенных стимулирующихрак онкогенов, выделенных, например, из опухолеродных вирусов (см. главу 20).В отличие от клеток человека, большинство крысиных клеток не отключает синтезтеломеразы, и их теломеры не укорачиваются с каждым делением.

Таким образом,если удалось избежать культурального шока, некоторые типы клеток крыс будутбесконечно делиться в культуре. Более того, в клетках грызунов часто происходятгенетические изменения, инактивирующие механизм контрольных точек, что приводит к спонтанному возникновению бессмертных клеточных линий.Клеточные линии проще всего получить из раковых клеток, но такие культуры, называемые трансформированными клеточными линиями, будут отличатьсяот культур, приготовленных из нормальных клеток. Например, трансформированные клеточные линии часто растут без прикрепления к поверхности, и они способны пролифелировать в культуральной чашке при значительно большей плотностиклеток.

Экспериментально можно привить сходные свойства и нормальным клеткампутем трансформации опухолеродным вирусом или химическим соединением. Полученные таким образом клеточные линии после введения в восприимчивое животноеспособны вызвать рост опухолей (хотя обычно на это способна только небольшаясубпопуляция, а именно раковые стволовые клетки — см. главу 20).Как трансформированные, так и нетрансформированные клеточные линииочень полезны для исследования клеток в качестве источников большого числаоднородных по типу и свойствам клеток. Более того, их можно хранить в жидкомазоте при –196 °С практически неограниченное время, и после разморозки они сохраняют свою жизнеспособность. Однако важно помнить, что клетки в обоих типахклеточных линий почти всегда принципиально отличаются от своих прародителейв тканях, из которых они были выделены.Некоторые из широко используемых клеточных линий перечислены в таблице 8.1.

Разные линии обладают разными достоинствами; например, эпителиальныеклетки линии PtK, полученные из кенгуровой крысы, в отличие от клеток многихдругих линий, которые округляются во время митоза, всегда остаются плоскими,что позволяет легко наблюдать митотический аппарат в действии.Часть III. Методы900Таблица 8.1. Некоторые часто используемые клеточные линииКлеточная линия*Тип и происхождение клеток3T3Фибробласт (мышь)BHK21Фибробласт (сирийский хомячок)MDCKЭпителиальная клетка (собака)HeLaЭпителиальная клетка (человек)PtK1Эпителиальная клетка (кенгуровая крыса)L6Миобласт (крыса)PC12Хромаффинная клетка (крыса)SP2Плазматическая клетка (мышь)COSПочка (обезьяна)293Почка (человек); трансформирована аденовирусомCHOR1Яичник (китайский хомячок)Клетка лимфомы для эффективной направленной рекомбинации(курица)Эмбриональная стволовая клетка (мышь)E14.1Эмбриональная стволовая клетка (мышь)H1, H9Эмбриональная стволовая клетка (человек)S2Макрофагоподобная клетка (Drosophila)BY2Недифференцированная клетка меристемы (табак)DT40*Многие из этих клеток получены из опухолей.

Все они способны к бесконечной репликациив культуре и обладают, по крайней мере, некоторыми из характерных свойств клеток, от которых онипроизошли.8.1.4.  Эмбриональные стволовые клетки способны совершитьпереворот в медицинеСреди наиболее перспективных с медицинской точки зрения клеточных линий выделяют эмбриональные стволовые (ЭС) клетки. Эти удивительные клетки,впервые полученные из внутренней клеточной массы находящегося на раннейстадии развития мышиного эмбриона, могут пролифелировать в культуре бесконечно и при этом сохранять неограниченный потенциал развития. Если клеткииз культуральной чашки поместить обратно в среду, соответствующую раннемуэтапу развития эмбриона, из них могут развиться клетки всех присутствующихв организме типов, включая половые (рис.