Часть 3 (Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (PDF)), страница 4

В обычной иммунной сыворотке, созданной для такой смеси, долямолекул антител, распознающих содержащийся в малом количестве компонент,будет недостаточной для того, чтобы принеси хоть какую-нибудь пользу. Но еслииз В-лимфоцитов, синтезирующих различные компоненты иммунной сыворотки,получить гибридомы, то из большого количества гибридомных клонов можноотобрать тот, который будет производить требуемое моноклональное антитело,и выращивать эту линию для синтеза антитела в неограниченных количествах.Таким образом, для любого белка в биологической смеси можно синтезироватьмоноклональное антитело.

Как только антитело готово, его можно использоватьдля локализации, наблюдения за движением и изучения структуры и функциибелка в клетках и тканях.Рис. 8.7. Получение клеточных гибридов. Можно провести слияние двух клеток и получить гетерокарион  — одну клетку с двумя ядрами.

Обычно суспензию клеток обрабатывают определеннымиинактивированными вирусами или полиэтиленгликолем, которые способствуют слиянию клеток путемизменения структуры их плазматической мембраны. В конце концов, гетерокарион претерпевает митоз,и получается гибридная клетка, в которой оболочки двух ядер разрушаются, а хромосомы объединяютсяв одном большом ядре. Такие гибридные клетки дают начало бессмертным гибридным клеточнымлиниям. Если одна из родительских клеток произошла из опухолевой клеточной линии, то гибриднуюклетку называют гибридомой.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 905Рис.

8.8. Приготовление гибридом, секретирующих моноклональные антитела против конкретногоантигена. Здесь интересующий антиген обозначен как «антиген Х». Селективная среда, используемаяпосле этапа слияния клеток, содержит ингибитор (аминоптерин), блокирующий нормальные биосинтетические пути образования нуклеотидов. Таким образом, клеткам приходится использовать альтернативныйпуть синтеза нуклеиновых кислот.

Этот путь у мутантных клеточных линий, выращенных из опухолевыхВ-лимфоцитов, нарушен, когда как у нормальных клеток, полученных из иммунизированных мышей, онработает. Поскольку ни один из использованных для исходного слияния клеточных типов не способенвыжить и пролифелировать сам по себе, в культуре остаются только клетки гибридомы.ЗаключениеТкани можно диссоциировать на составляющие их клетки, которые, в своюочередь, можно разделить по типам и очистить для биохимического анализа илисоздания клеточных культур.

Многие животные и растительные клетки выжи-906Часть III. Методывают и пролифелируют в чашке Петри при условии наличия в ней подходящейкультуральной среды, питательных веществ и соответствующих сигнальныхмолекул. Несмотря на то что большинство животных клеток перестает делиться после конечного числа клеточных делений, обессмерченные при помощиспонтанных мутаций или генетических манипуляций клетки могут неограниченное время существовать в виде клеточных культур. Эмбриональные стволовыеклетки могут неограниченно пролифелировать в культуральной чашке, сохраняяспособность дифференцироваться в различные типы клеток организма.

Такимобразом, они обладают огромным медицинским потенциалом. Клетки гибридомышироко используются для получения неограниченного количества однородныхмоноклональных антител, применяемых для обнаружения и очистки клеточныхбелков, а также для диагностики и лечения заболеваний.8.2.  Очистка белковЗадача выделения из тысяч присутствующих в клетке типов белков одногоединственного является непростой, но ее необходимо решить, чтобы исследоватьфункцию белка in vitro. Ниже в этой главе мы покажем, как метод рекомбинантных ДНК значительно упрощает эту задачу, заставляя клетку синтезировать большие количества нужного белка, облегчая таким образом его выделение и очистку.Независимо от того, является ли источником белка сконструированная методамибиоинженерии клетка или интактная ткань, процесс очистки обычно начинаетсяс субклеточного фракционирования для снижения многокомпонентности материала.Затем проводят очистку белка, на каждом шаге увеличивая ее специфичность.8.2.1.  Клетки можно разделить на составляющие ее фракцииЧтобы очистить белок, его нужно извлечь из клетки.

Клетки можно разрушить несколькими способами: их можно подвергнуть осмотическому шоку илиультразвуковой вибрации, протащить через маленькое отверстие или измельчитьв гомогенизаторе. В результате этих процедур разрушается большинство мембранклетки (включая плазматическую мембрану и эндоплазматический ретикулум), небольшие фрагменты которых тут же заново замыкаются, образуя везикулы. Однако,при осторожном проведении процедур разрушения, такие органеллы, как ядро,митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы, остаются нетронутыми.Таким образом, суспензия клеток превращается в густую кашицу (так называемыйгомогенат или экстракт), содержащую различные замкнутые мембранные органеллы, каждая из которых обладает характерным размером, зарядом и плотностью.При условии правильного подбора среды гомогенизации (путем проб и ошибокдля каждой органеллы), различные компоненты, включая везикулы, получившиесяиз эндоплазматического ретикулума — микросомы, сохраняют большинство своихестественных биохимических свойств.Затем необходимо разделить компоненты гомогената.

Такого рода фракционирование клеток стало возможным только после коммерческой разработки в начале1940-х гг. прибора, носящего название «препаративная ультрацентрифуга». В нейпроисходит высокоскоростное вращение экстракта разрушенных клеток (рис. 8.9).Это позволяет разделить клеточные компоненты по размеру и плотности: в целом,чем крупнее частица, тем большая центрифужная сила будет на нее действовать,и тем быстрее она будет вращаться.

При относительно низких скоростях седимен-Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 907тируют (оседают) крупные компоненты, такие как ядра, с образованием осадкана дне центрифужной пробирки; при больших скоростях и длительном временицентрифугирования можно собрать сначала маленькие замкнутые везикулы, а затем рибосомы (рис. 8.10). Все эти фракции не будут чистыми, но значительноеколичество загрязнителей можно удалить путем ресуспендирования осадка и повторного проведения центрифугирования.Центрифугирование почти всегда является первым шагом фракционирования,но с его помощью можно разделить только значительно различающиеся по размерукомпоненты.

Более высокого уровня разделения можно добиться путем нанесениятонкого слоя гомогената на разбавленный раствор соли, заполняющий центрифужную пробирку. Во время центрифугирования различные компоненты смесибудут двигаться через солевой раствор как отдельные полосы, каждая со своейскоростью. Этот процесс называется скоростной седиментацией (рис. 8.11, а).Чтобы этот метод был эффективным, полосы должны быть защищены от конвекционного смешивания, которое обычно происходит, когда более плотный раствор(например, содержащий органеллы) оказывается над менее плотным (растворомсоли).

В специальном приборе для смешивания раствор в пробирке усиливаютслабым градиентом сахарозы. Благодаря получающемуся в результате градиентуплотности более плотный раствор будет на дне пробирки, и каждая область солевогораствора будет иметь большую плотность, чем раствор над ней, и, таким образом,конвекционное смешивание не будет мешать разделению.При седиментации через такие разбавленные градиенты сахарозы различныеклеточные компоненты будут формировать отдельные полосы, которые можноРис. 8.9. Препаративная ультрацентрифуга. Проба находится в пробирке, которую помещают в цилиндрические отверстия в металлическом роторе.

За счет быстрого вращения ротора создается огромнаяцентробежная сила, заставляющая частицы в образце осаждаться. Вакуум уменьшает трение, препятствуя перегреву ротора и позволяя системе охлаждения поддерживать постоянную температуруобразца 4° С.908Часть III. МетодыРис. 8.10. Фракционирование клеток при помощи центрифугирования.

Многократное центрифугирование с постоянным увеличением скорости позволяет разделить гомогенаты клеток на компоненты. В целом, чем меньше субклеточный компонент, тем большая центробежная сила необходима для его седиментации. Типичные значения для различных шагов седиментации:низкая скорость: 1 000 g, 10 минутсредняя скорость: 20 000 g, 20 минутвысокая скорость: 80 000 g, 1 часочень высокая скорость: 150 000 g, 3 часа.Глава 8.

Манипуляция белками, ДНК и РНК 909выделить по одной. Относительная скорость седиментации каждого компонентазависит, в первую очередь, от его размера и формы, обычно описываемых в терминах коэффициента седиментации, или величины S. Современные центрифугивращаются со скоростью до 80 000 оборотов в минуту, а центробежная сила в нихможет в 500 000 раз превышать силу гравитации.

Эти огромные силы заставляютРис. 8.11. Сравнение методов скоростной седиментации и седиментационного равновесия. (а) При скоростной седиментации субклеточные компоненты, нанесенные на содержащий сахарозу разбавленныйраствор, осаждаются с разной скоростью в зависимости от размера и формы. Чтобы избежать конвекционного смешивания различных полос, вызываемого небольшими различиями в температуре или концентрации раствора, в пробирке создают непрерывный слабый градиент сахарозы, концентрация которойвозрастает в направлении дна пробирки (обычно от 5 до 20 % сахарозы). После центрифугированияразные компоненты можно выделить по одному путем прокалывания дна пластиковой центрифужнойпробирки и сбора капель, как показано на рисунке.

(б) В методе седиментационного равновесия субклеточные компоненты движутся вверх или вниз при центрифугировании в градиенте до тех пор, пока онине достигнут положения, в котором их плотность будет совпадать с плотностью окружающего раствора.Несмотря на то что здесь показан градиент сахарозы, для разделения белков или нуклеиновых кислотудобнее использовать более плотные градиенты, которые можно создавать при помощи хлорида цезия.Получившиеся в равновесии полосы можно собрать так же, как показано на рис. 8.11, а.910Часть III.