Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности, страница 7

Интересно также, что GC состав (69%) нуклеотидной последовательностимаксимальный из всех описанных ранее для ПА.Таблица 6. Предполагаемые факторы, ответственные за повышенную стабильностьaxПА.Фермент Солев. мостики % N+Q % S+T%A%RR/K%PaxПА5068,969,0813,68 7,21 13,68 6,84ecПА47811,9312,718,764,238,765,15prПА39214,0212,826,682,676,685,4744axПА обладает также несколько улучшенными кинетическими характеристиками. Вреакции гидролиза NIPAB наблюдается 2-3-кратное улучшение константы специфичности посравнению с ecПА.Недавно испанские ученые открыли термостабильную ttПА (21% идентичности ecПА)из термофильного источника, для которой оптимум экспрессии и активности одновременноприходится на 75°C (t1/2 составляет 9 часов), что на 15°C больше, чем для axПА. Ферменттакже характеризуется повышенной операционной стабильностью по отношению корганическим растворителям, детергентам и экстремальным pH.

При этом pH оптимумактивности приходится на pH 4. Для фермента характерна субстратная специфичность поотношению к алифатическому пенициллину-K, однако величина kcat/KM довольно низкая(0,016 мкМ/с), а по отношению к Пен-G константа специфичности падает на 5 порядков [87].Подводя итог, стоит отметить, что под некоторые практические задачи можноподобрать пригодный природный вариант ПА. Однако, к сожалению, возможности белковойинженерии новых объектов весьма ограничены. Практически ни для одного из природныхПА не описана РСА структура (исключения - ecПА и afПА), большинство ферментов неохарактеризовано в биотехнологически важных реакциях, а также отсутствуют данные помутационному анализу.

Все это значительно сокращает возможности для изученияструктурно-функциональных особенностей и рационального изменения свойств. Такжеследует отметить, что для каждого нового объекта необходимо оптимизировать методыэкспрессии, выделения и очистки. Таким образом, наиболее изученная ecПА является вомногих отношениях более привлекательной. При этом стоит отметить, что закономерности,найденные для ecПА, можно переносить и на другие объекты, как это сделано, например, вработах [76; 88; 89].451.2.2 Белковая инженерия ПА1.2.2.1 Случайный мутагенез«Направленная эволюция»Первые шаги в целенаправленном улучшении каталитических свойств ПА с помощьюслучайного мутагенеза были реализованы методом «направленной эволюции», основанной населекции жизнеспособных штаммов при использовании ауксотрофов.

В 1989 г. американскиеученые использовали лейциновый ауксотроф для улучшения сродства ecПА к фенилацильнойчасти, содержащей α-аминогруппу [90]. Эксперимент проводили при пониженных значенияхpH, в условиях почти полного протонирования α-аминогруппы субстрата. Исходнымсубстратом и единственным источником лейцина при этом служил D-ФГ-лейцин. Врезультате эксперимента был получен мутант, для которого при pH 6,5 kcat/KM увеличена в 10раз, при том что kcat увеличилась в 40 раз.

Интересно, что улучшение тем более характерно,чем ниже pH. Таким образом, авторы показали возможность изменять специфичность ecПА иполучать мутанты, которые при низких pH гидролизуют амиды с α-аминофенилацетильныммотивом более быстро. В работe [91] для kcПА аналогичным образом были улучшеныкинетические параметры для Сα-замещенных производных ФУК, в том числе ФГ, МК, СαCH3-ФУК, адипил, аминоадипил, фталил боковых радикалов.

Также наблюдали увеличениеактивности в гидролизе ряда антибиотиков, в том числе в реакции пG. Авторы обнаружили,что за приобретенные свойства отвечает мутация F360V, которая соответствует остатку bF71в ecПА (см.приложение 1.1). В работе [92] при использовании пролиновых и лейциновыхауксотрофов удалось достичь улучшения в гидролизе ряда антибиотиков, в том числе на 30%ускорить реакцию пG для мутанта G359D, что соответствует bG70 в ecПА. При этом эффект,предположительно, достигается не за счет улучшения специфической активности (она, какпоказано в той же работе, уменьшается в 3 раза), а за счет значительного ухудшенияингибирования продуктом гидролиза ФУК.

Для другого мутанта («B10») удалось улучшитьтермостабильность при 45°С почти в 4 раза по сравнению с ecПА. Однако уже при 50°Сэффект исчезает.ДНК-шаффлингМетод, который стал популярен в последние годы и который успешно используетсядля оптимизации ферментов, вовлеченных в технологические процессы, является ДНК46шаффлинг. Эта методика включает в себя стадию рекомбинации гомологичных молекул ДНКиз различных организмов, в результате чего получается набор белков с самымиразнообразными мутациями. Одним из вариантов этого метода является конструированиегибридных геномов в одном семействе, когда рекомбинируются гены гомологов с высокимуровнем идентичности ДНК.В работе [93] объединяли гены ecПА, kсПА (85% идентичности по ДНК ecПА) и prПА(52% идентичности по ДНК ecПА), при этом наблюдали незначительное улучшение S/Hлишь относительно prПА.

В более поздней работе [82], с той же целью, брали ecПА, krПА(77% идентичности по ДНК ecПА) и prПА (52% идентичности по ДНК ecПА). Из 700 клонов81 трансформант синтезировал ампициллин не более чем в 2 раза хуже, чем ecПА, 19трансформантов обнаруживали улучшение параметра S/H. Среди полученных гибридов 3обнаружили заметные улучшения параметров в реакциях 1, 2а, 3 (табл.7) по сравнению сkrПА. Также наблюдали увеличение скоростей превращения.Таблица 7. Синтетические свойства родительских и гибридных ПА в реакции 1а.Фермент αβ, М-1 γecПА7,8780,14 2,2100krПА12,7 980,19 2,1110prПА5,80,30 1,9596G811,1 1300,12 2,614973C411,6 1200,12 2,4956B116,40,13 2,511532115Pmax, мМ vPs %Интересно отметить, что для гибрида 6B11 избирательно улучшаются все параметры,при этом уменьшение α, что было показано в независимом эксперименте, вызвано 2-кратнымувеличением KP для продукта синтеза – ампициллина, а для гибрида 73С4 увеличение αвызвано 2-кратным увеличением KS для D-ФГА.

Секвенирование показало, что этигибридные мутанты берут начало от ecПА и содержат часть гена от krПА. Также были47найдены случайные мутации, не относящиеся ни к одному из родительских генов,большинство из которых находилось далеко от активного центра. Для изучения вклада отмутации bG375S, найденной в гибриде 6G8, авторы сделали соответствующую одиночнуюзамену в ecПА.

Было показано увеличение максимального выхода продукта на 22%, асоотношения S/H на 80% при сохранении уровня активности, по сравнению с ecПА. При этомне наблюдали увеличения параметра . Весьма интригующим является тот факт, что остатокbG375 находится на значительном расстоянии от активного центра (17A до каталитическогоbS1 и 10A до ближайшей карбоксильной группы бета-лактамного кольца субстрата). Ещеодна мутация aD148G, обнаруженная в двух гибридах и также расположенная вдалеке отактивного центра, для вновь созданного одиночного мутанта дает увеличение выхода всинтезе ампициллина на 20% при увеличении S/H на 80%.

В данном случае остатокформирует множественные водородные связи с консервативными атомами, которые, помнению авторов, при снятии заряда перестают удерживать каталитическую петлю,содержащую остатки aR145 и aF146, что приводит к ее более полному вовлечению всвязывание по механизму индуцированного соответствия. В результате, аD148, также как иbG375, становятся потенциальными мишенями для направленного мутагенеза.

Стоитподчеркнуть, что эти мишени практически нельзя идентифицировать на основании однихлишь рациональных подходов. Однако, к сожалению, авторы не дают никаких другиххарактеристик мутантов. Так, например, не понятно, что при этом происходит состабильностью фермента. Также, на наш взгляд, весьма опрометчиво со стороны авторовприводить математически рассчитанные на основании трех экспериментальных параметровкомплексные значения Pmax и не учитывать существенную погрешность подобной оценки.Циклическая пермутацияПолучение одноцепочечной ПА, путем объединения а и b субъединиц при помощикороткого пептида позволяет получить фермент, созревание которого больше не зависит отавтопротеолитических стадий процессинга.

С целью получить два антипараллельных β-тяжана двух близкорасположенных (5A) концах субъединиц ecПА, Osuna J. с соавторами удалилипервые 4 аминокислоты с N-конца а-цепи и последние 2 аминокислоты b-цепи [94]. Длясоединения двух концов в общую антипараллельную β-структуру посредством включенияпотенциального β-поворота был предложен случайный тетрапептидный линкер.

Для подбораоптимального состава линкера была генерирована библиотека мутантов объемом примерно48106 вариантов, 40% которых отсеялись сразу на этапе роста. На этапе проверкиспецифической активности было отобрано 15 линкеров. Оказалось, что все пермутированныеварианты обладают пониженной активностью в реакции пG (табл.8). Варианты с линкерамиNEGM и DPAG были оттитрованы при помощи PMSF. Однако, никакой детальнойхарактеристики препаратов авторы, к сожалению, не приводят.NEGMPGLRGGEADPAGGGLKEPQRGGGRGAGPGVGGDALQGAGGGSGRAAVAESSGARDТаблица 8.

Последовательности линкеров функциональных одноцепочечных ecПА.Активность%100 22151435851827181613732939ЛинкерДТ1.2.2.2 Направленный мутагенезАнализ выравниванийЕще до того, как была расшифрована структура ПА, производились попытки понаправленному мутагенезу отдельных остатков. В работе [95] на основании выравниванияпервичных последовательностей ecПА с другими пенициллин-связывающими белкамиавторы получили информацию о некоторых консервативных регионах, в том числе былосделано предположение об участии одного из них (M168-K191, номерация предшественника)в связывании Пен-G.

В работе [96] авторы установили, что замена остатка M168,соответствующего aM142 в ecПА, может влиять на специфичность ПА, а в работе [97] былозафиксировано примерно 2-кратное улучшение термостабильности для M168A по сравнениюс kcПА ДТ. Данный остаток авторы работы [88] заменяли на A и V в kcПА и получилиточечные мутанты с заметно ухудшенной специфичностью к Пен-G и Пен-V по сравнению сkcПА ДТ. Также для данных мутантов авторы наблюдали нелинейный характер зависимостиостаточной активности от концентрации ФМСФ, что, однако, может быть связано с чистотойпроводимого эксперимента. Аналогично, на основании выравнивания, приведенного в работе[95], те же авторы предложили мутанты kcПА K375N и H481Y, соответствующие bK86 иbH182 в ecПА, для которых в случае фенилацетил-4-аминобензойной кислоты былозафиксировано изменение в KM при отсутствии изменения в kcat.