Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности, страница 4

Одним из принципиальных подходов для устраненияданных недостатков и увеличения выхода является оптимизация условий проведения синтеза.Чтобы уменьшить негативное влияние воды, как нуклеофила, конкурирующего заацилфермент наряду с акцептором ацильной части, Юшко М.И. и Швядас В.К. предложилипроводить реакцию в твердофазной системе [42]. Было показано, что эффективность синтезаампициллина сильно возрастает при уменьшении содержания воды в системе (рис.6А), атакже при увеличении количества внесенной иммобилизованной пенициллинацилазы(рис.6Б).22АРисунок6.А:БНакопление ампициллина в твердофазном режиме синтеза,катализируемого ПА.

Содержание воды: 1-35%, 2-30%, 3-20%, 4-15%, 5-10%. Б: Зависимостьмаксимального выхода ампициллина от количесва иммобилизованной ПА в системе.В работе [43] Юшко М.И. с соавторами воплотили идею использования эффектовкинетического пересыщения системы по отношению к исходным субстратам. При этом длягомогенной пересыщенной системы 6-АПК/амид D-ФГ удалось добиться увеличения выходапо сравнению с твердофазной. Улучшения эффективности ацильного переноса можно такжедостигнуть при использовании техники pH-градиента [44; 45]. Для этого реакцию начинаютпри pH 7, благодаря чему достигается хорошая растворимость 6-АПК, а по мере протеканияреакции и, следовательно, расходования 6-АПК, раствор плавно подкисляют (до pH 6.3),сдвигая термодинамическое равновесие в сторону синтеза, при этом концентрация 6-АПКвсегда близка к насыщающей. Еще одним способом, повышающим эффективностьсинтетического процесса, является техника, в которой активированный донор и нуклеофилдобавляются по ходу их расходования, при этом концентрация нуклеофила поддерживаетсяна уровне насыщения [44; 46].

Показано, что при использовании полунепрерывного режимапроведения реакции эффективность синтеза может быть увеличена до практическиколичественного выхода по 6-АПК и 85% по донору.Существует также ряд методов, основанных на внесении в реакционную средуразличных органических соединений.

Внесение таких веществ, как диметилсульфоксид,диметилформамид, глицерин, бутандиол, вызывает заметное изменение значений pKaионизации функциональных групп [47; 48], что наряду с внесением в систему веществпонижающих активность воды, таких как сорбит, глицерин, сахароза [49; 50], позволяетзаметно повысить выход целевого продукта. Есть данные, что при оптимальном содержанииметанола в системе (50-60%) выход Пен-G удается увеличить в 8 раз, однако полученный23эффект представляет скорее научный, а не практический интерес (увеличение выхода с 3,8 до31%)[51].

Увеличения выхода также можно достичь при проведении реакции в двухфазнойсреде путем экстракции целевого соединения в органическую фазу. Например, припроведении реакции в двухфазной системе хлороформ-вода (1об.%) выход Пен-Gувеличивается с 10 до 60% по сравнению с реакцией в водной среде [52].Несмотря на ряд преимуществ, реальное применение данных методов весьмаограничено.

Использование описанных техник требует существенного усложнения системы,аиспользованиеразличныхорганическихдобавоксказываетсянастабильностибиокатализатора и требует введения дополнительных стадий выделения и очистки.Альтернативным решением проблемы может быть использование более эффективногокатализатора. В отличие от термодинамически контролируемого синтеза, в кинетическиконтролируемом свойства фермента влияют на выход целевого продукта. В связи с этимполучение катализатора с улучшенными кинетическими характеристиками представляетбольшой практический интерес (см. раздел 1.2).1.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединенийДругимпромышленноактуальнымиперспективнымзначимыхобластяхявляетсянаправлениемполучениеиспользованияПАвэнантиомерночистыхаминосоединений.В работе [53] было впервые проведено высокоэффективное биокаталитическоеацилирование аминосоединений в водной среде.

Было показано, что катализируемое afПАстереоселективное ацилирование аминосоединений, содержащих ароматические группы, вотличие, например, от ацилирования в органических средах липазами [54], протекаетчрезвычайно быстро с высокой хемоселективностью, а образующийся продукт может бытьвпоследствии деацилирован тем же ферментом. Обе стереоселективные стадии –ацилирование и деацилирование могут быть объединены в единый интегральныйбиокаталитический метод разделения энантиомеров аминосоединений, использующий веськаталитический потенциал afПА, где на первой стадии проводится исчерпывающееацилирование активного L-энантиомера в рацемате аминосоединения и после отделениянезатронутого D-антипода на второй стадии проводится гидролиз N-ацильного производногос образованием свободной L-формы:241.

Стереоселективное ацилирование :XXNH2NH2R1R2R1R2HNПА++ONH2H20, pH10YR2OR1NH2+R1R2DY2. Стереоселективный гидролиз:XXHNR2ONH2OHПА+H20, pH7.5OR1R1R2LYYОбе реакции, катализируемые afПА, проходят в водных растворах с высокойэффективностью. По сравнению с разделением энантиомеров, основанном на одномбиокаталитическомпревращении,метод,сочетающийдвепоследовательныеферментативные реакции, позволяет получить оба энантиомера и обеспечивает двойнойконтроль энантиоселективности.

Природный катализатор ecПА эффективен для полученияоптически чистых аминокислот, что основано на высокой стереоспецифичности к этомуклассу аминосоединений. Однако, для аминоспиртов и аминов, содержащих алифатическиегруппы, стереоспецифичность ecПА и afПА на порядки ниже [55]. В связи с этим получениекатализатора с улучшенной стереоспецифичность к данным соединениям представляетбольшой практический интерес.251.1.3 Структурно-функциональные особенности ecПА1.1.3.1 Структура предшественникаЗрелый фермент ecПА – это периплазматический гетеродимер с молекулярной массой86 кДа, состоящий из a- и b-цепей (209 и 566 аминокислот, соответственно) [16]. Обесубъединицы фермента образуются из общего предшественника (рис.7) в результатеавтокаталитического посттрансляционного созревания [56].С-конецN-конецsa (23КДа)prob (63КДа)Рисунок 7.

Предшественник ecПА.Сигнальная последовательность (s) состоит из 26 аминокислот и предназначена дляпрямого транспорта предшественника в периплазму, а 54-аминокислотный участок между aи b-цепями (pro) влияет на окончательное сворачивание цепей. Также известно, что ион Ca2+,присутствующий в структуре белка, способствует процессингу [57].1.1.3.2 Активный центрПервый рентгеноструктурный анализ ПА был проведен в 1995 году для ecПА cразрешением в 1,9 Å (1pnk) [16]. Согласно полученным данным, гетеродимер имеетусредненные размеры 70x50x55Å и состоит из двух тесно переплетенных цепей,формирующих типичный αββα мотив укладки и образующих пирамидальную структуру сглубокой чашеобразной выемкой, на дне которой находится активный центр (рис.8).26Рисунок 8.

Трехмерная структура ПА (стереоизображение). а-субъединица показанакрасным цветом, b-субъединица – синим.В ранних работах по изучению ПА было показано, что ключевую роль в катализеиграет остаток серина, ковалентная модификация которого при помощи ФМСФ приводит кполной потере ферментом каталитической активности [58]. Данные РСА по ковалентномукомплексу ecПА с ФМСФ (1pnm) [57] уточнили, что этим ключевым остатком является Nконцевой серин b-цепи. Тем не менее, вблизи остатка bS1 нет групп (H, E, D), которыеобычно присутствуют в активном центре сериновых протеаз и принимают участие вкаталитических актах ацилирования и деацилирования посредством переброса протона пообразуемой ими цепочке сопряженных кислот и оснований.

Их роль выполняет собственнаяаминогруппа серина, что дало основание отнести ПА к классу так называемых гидролаз с Nконцевым нуклеофилом или Ntn-классу (N-terminal nucleophile) [59].1.1.3.3 Механизм катализаМеханизм модельной реакции, исследованный Чиловым Г.Г. с соавторами методамиквантовой механики, можно описать следующим образом [60]. Атака атома Oγ N–концевогосерина по карбонильному атому углерода субстрата может сопровождаться передачейпротона с гидроксильной группы на собственную α-аминогруппу. Образующийся при этомоксианион может стабилизироваться взаимодействием с амидной группой bN241 и атомомазота полипептидного остова, принадлежащему bA69.

Далее протон, акцептированныйаминогруппой серина, может передаваться по той же самой цепочке на уходящую группу.QM/MM моделирование полного каталитического цикла гидролиза ПенG под действием27есПА показало [61], что α-аминогруппа N-концевого каталитического βS1 действительноучаствует в прямой передаче протона на основных каталитических стадиях и совместно состатками оксианионного центра βA69 и βN241, а также остатками βR263 и βQ23 образуетсистему взаимодействий, приводящих к стабилизации тетраэдрических интермедиатов,переходных состояний, ориентации субстрата и аминокислотных остатков активного центрафермента. Остатки βR263 и βQ23 обеспечивают целостность каталитического механизма:βR263 участвует в ориентации субстрата, а также α-аминогруппы βS1 и координируетостаток оксианионного центра βN241 в ходе всего каталитического цикла, в то время какосновная цепь βQ23 отвечает за ориентацию как βS1, так и субстрата.

Таким образом былаполученаважнейшаяинформацияоранеенеизвестнойспособностиN-концевогоаминокислотного остатка в Ntn-гидролазах, и есПА в частности, напрямую активироватьнуклеофильную группу без участия дополнительной молекулы воды. Предполагаемыймеханизм катализа представлен на схеме 2. Интересно отметить, что в представлении РСАпредполагалось участие молекулы воды в цепи переноса протона [16].ONbAsn241ONH2HObAla69OR1R1R1ONH2R1ONHHNH3OOHHONu:bSer1NH2(1)NH3+bSer1(2)OHO:2bSer1NH2R1Nu(3)Схема 2.