Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности
Описание файла
PDF-файл из архива "Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова________________________________________________________________________________Факультет биоинженерии и биоинформатикиНаучно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерскогона правах рукописиПанин Николай ВладимировичНаправленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coliдля изменения каталитических свойств и стабильности02.00.15 кинетика и катализ03.01.06 биотехнология(в том числе бионанотехнологии)диссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:д.х.н., профессор Швядас В.К.к.х.н., в.н.с.
Гуранда Д.Т.Москва 2014Диссертация посвящается светлой памяти моего отцаПанина Владимира Григорьевича.2ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................. 7ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................................... 121 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ........................................................................................................ 151.1 Пенициллинацилаза ..................................................................................................................
151.1.1 Общие сведения................................................................................................................ 151.1.1.1 Физиологическая роль ПА ............................................................................................. 151.1.1.2 Каталитическая активность ..................................................................................... 151.1.1.3 Субстратная специфичность ..................................................................................... 161.1.1.4 Стереоспецифичность .................................................................................................
181.1.2 Основные области применения ПА ................................................................................ 191.1.2.1 Получение бета-лактамных антибиотиков .............................................................. 191.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединений ............................................................. 241.1.3 Структурно-функциональные особенности ecПА ........................................................ 261.1.3.1 Структура предшественника ..................................................................................... 261.1.3.2 Активный центр............................................................................................................ 261.1.3.3 Механизм катализа .......................................................................................................
271.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре. .................................................... 291.1.3.5 Участок связывания ацильной части. ........................................................................ 311.1.3.6 Участок связывания амидной части. ......................................................................... 321.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов.
.......................... 341.2.Белковая инженерия и поиск новых ПА............................................................................... 361.2.1 Поиск природных ПА ...................................................................................................... 381.2.2 Белковая инженерия ПА ..................................................................................................
4631.2.2.1 Случайный мутагенез ................................................................................................... 461.2.2.2 Направленный мутагенез ............................................................................................. 491.2.2.3 Комбинированные методы .......................................................................................... 581.2.2.4 Расширение возможностей белковой инженерии .....................................................
661.2.3 Заключение ....................................................................................................................... 682 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................................................... 702.1 Материалы и оборудование ..................................................................................................... 702.2 Методы ......................................................................................................................................... 732.2.1 QuikChange ПЦР мутагенез .............................................................................................
732.2.2 ПЦР мутагенез с перекрыванием.................................................................................... 742.2.3 Наработка биомассы ........................................................................................................ 752.2.4 Выделение и очистка мутантных препаратов ПА......................................................... 752.2.5 Приготовление компетентных клеток ............................................................................
762.2.6 Электрофорез в агарозном геле ...................................................................................... 772.2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле ...................................................................... 772.2.8 Секвенирование ................................................................................................................
792.2.9 Титрование активных центров ........................................................................................ 792.2.10 Определение кинетических параметров гидролиза цветного субстрата .................. 792.2.11 Изучение pH- и термостабильности ............................................................................. 792.2.12 Ингибиторный анализ .................................................................................................... 802.2.13 Определение параметра S/H .......................................................................................... 802.2.14 Определение параметров β и γ ...................................................................................... 812.2.15 Определение параметра α .............................................................................................. 812.2.16 Определение максимального выхода реакции ............................................................
812.2.17 Определение стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола ифенилаланинола ........................................................................................................................ 8242.2.18Определениестереоселективностивреакциигидролизафенилацетилфенилаланинола .................................................................................................. 822.2.19 ВЭЖХ .............................................................................................................................. 832.2.20 Компьютерное моделирование .....................................................................................
852.2.21 Методы статистической обработки результатов......................................................... 863 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................................................................... 873.1 Постановка задачи ..................................................................................................................... 873.2 Получение генов мутантных форм......................................................................................... 913.3 Экспрессия, выделение и очистка .......................................................................................... 963.4 Титрование активных центров, каталитическая активность и термостабильность ..
983.5 Эффективность синтеза .......................................................................................................... 1033.5.1 Определение параметров α,β,γ ..................................................................................... 1033.5.2 Уточнение к вычислению параметра α. ...................................................................... 1073.6 Стереоселективность .............................................................................................................. 1103.7 Анализ экспериментальных данных ................................................................................... 1163.8 Мутагенез для изменения каталитической активности ..................................................
1213.8.1 Мутации bS1T, bS1C, bT68S, bS1T+bT68S................................................................... 1213.8.2 Мутации bI177V, bW154F ............................................................................................. 1253.9 Мутагенез для изменения эффективности синтеза ...........................................................
1273.9.1 Мутации bF24A, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R .......................................... 1273.9.2 Мутация aS149R............................................................................................................. 1343.9.3 Мутация bN388Q ........................................................................................................... 1373.9.4 Мутации bF256R, bA255R .............................................................................................
1413.10 Мутагенез для изменения стереоселективности.............................................................. 1473.10.1 Мутации bF71L, bF71A ............................................................................................... 1473.11 Мутагенез для изменения стабильности ........................................................................... 15453.11.1 Мутации bQ292R, bI329E ............................................................................................ 1543.11.2 Мутации bD484N, bD484H..........................................................................................
1573.11.3 Мутация bR297A .......................................................................................................... 1633.11.5 Мутация aA173C+bA410C .......................................................................................... 1663.11.6 Мутации bR533C+bW500C, bM485R ......................................................................... 167ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ............................................................................
