Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 9

На Рис. 8 представлены зависимости концентрации липосом всупернатанте от общей концентрации липосом в системе. Видно, что все липосомыколичественно связывались с СК+ вплоть до некоторой концентрации Lпред (мг/мл),выше которой липосомы начинали появляться в растворе. Величина Lпред зависела отсостава липосом и уменьшалась по мере возрастания доли анионного липида вCлипосом в супернатанте, мг/мллипосомальной мембране.5 4 3210.40.20.81.6Cлипосом в системе, мг/млРис.

8. Зависимость концентрации КЛ2-/ФХ липосом в надосадочной жидкости от общейконцентрации липосом в системе. ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5); [СК+] = 1×10-4 основомоль/мл; 10-2 М боратный буфер, рН 9.2; 20 ºС.Полученные результаты позволили рассчитать предельное количество липосом,адсорбированных на одной поликатионной щетке, N. Для этого Lпред была представленав виде количества липосом в литре раствора (CЛ):46CЛ = (Lпред × S × Na) / (2πd2 × M),(1)где S – площадь, приходящаяся на одну липидную молекулу (0.7 нм2), d – среднийдиаметр липосомы (50 нм), M – средняя молекулярная масса липида (760 Да), Na – числоАвогадро.

Количество CК+ в литре раствора (CК) было рассчитано в предположении,что основной вклад в вес CК+ вносит полистирольное ядро:CК = 6К / (πD3 × ρ),(2)где К – концентрация СК+, в нашем случае 0.38 мг/мл, D – диаметр полистирольногоядра (100 нм) и ρ – его плотность (1.05 г/см3). Это позволило рассчитать N какN = CЛ / CК = (Lпред × S1 × Na × D3 × ρ) / (6CК × d2 × M)(3).Подстановкой экспериментально определенных величин CЛ (Рис. 8) в уравнение 3была получена зависимость N от доли анионного липида в мембране  (Рис.

9). Этазависимость имеет нелинейный характер: величина N резко спадает от ≈ 80 до ≈ 40 приувеличении  от 0.05 до 0.1 и становится равной 15 при  = 0.4.N80400.20.4νРис. 9. Зависимость количества КЛ /ФХ липосом, связаных с одной СК+, от доли заряженного липида2-в мембране. 10-2 М боратный буфер, рН 9.2; 20 ºС.Принципиальный вопрос касается стабильности комплексов к диссоциации насоставляющие компоненты – CК+ и липосомы в водно-солевых средах.

Катионные47полимеры являются эффективными тушителями флуоресценции [135]. Поэтому заформированием и последующей диссоциацией комплексов следили, регистрируяинтенсивность флуоресценции ФИТЦ-меченого липида, встроенного в липосомальнуюмембрану. Добавление суспензии CК+ к суспензиям меченых липосом всех составовприводило к уменьшению интенсивности флуоресценции метки (Рис.

10). Последующеедобавление раствора соли (NaCl) оказывало различный эффект в зависимости отФлуоресценция, о.е.содержания анионного липида в адсорбированных липосомах.1.0543210.50.61.2[СК+]×10-4, осново-моль/лРис. 10. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе СК+/липосомы КЛ2-/ФХот концентрации добавленных СК+. ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 04 (5); 10-2 М боратный буфер,рН 9.2; 20ºС.Комплексы липосом с  = 0.05 полностью диссоциировали при [NaCl] = 0.15 М,комплексы липосом с  = 0.1 при [NaCl] = 0.25 М, в то время как липосомы с  ≥ 0.2формировали комплексы, которые не диссоциировали в растворах с концентрацией солидо 1.2 М (Рис. 11).Флуоресценция, о.е.481.0123,4,50.50.10.20.31.2[NaCl], MРис.

11. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе СК+/липосомы КЛ2-/ФХот концентрации добавленной соли NaCl. ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 04 (5); концентрациялипосом 1 мг/мл; [КЛ2-]/[СК+] = 2/3; 10-2 М боратный буфер, рН 9.2; 20ºС.Необратимое связывание липосом с СК+ могло быть результатом встраиванияфрагментов привитых поликатионных цепей в липосомальные мембраны. Такоевстраивание должно было сопровождаться образованием дефектов в липидном бислое ивытеканием водного содержимого из липосом в окружающий раствор.

ЦелостностьФХ/КЛ2- липосом в комплексе с СК+ анализировали, используя метод кондуктометрии.Для этого были приготовлены липосомы, внутренний водный объем которых былзаполнен 1 М раствором NaCl. Нарушение целостности мембраны приводило кувеличению электропроводности липосомальной суспензии. Полученный результатсравнивали с электропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента –разрушения липосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которуюпринимали за 100%. Оказалось, что добавление липосом с ν ≤ 0.3 к суспензии СК+ невлияло на электропроводность системы (Рис.

12, кривые 1-4), в то время как добавление49липосом ν = 0.4 приводило к возрастанию электропроводности (кривая 5). Инымисловами, после связывания с СК+ целостность липосом с ν ≤ 0.3 сохранялась,увеличение доли анионного липида до 40 мол% сопровождалось появлением дефектов,ΔΩ/ΔΩmaxчерез которые происходило вытекание раствора NaCl.0.850.41,2,3,450100t, минРис. 12. Зависимость относительной электропроводности суспензии СК+/ липосомы КЛ2-/ФХ отвремени. ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; [КЛ2-]/[СК+]= 2/3; 10-2 М боратный буфер рН 9.

2; 20ºС.Для сравнения мы добавили ФХ/КЛ2- липосомы, заполненные раствором NaCl, ксуспензии 100 нм полимерных микросфер без привитых поликатионных цепей наповерхности. В этом эксперименте были использованы «традиционные» микросферы скатионными группами на поверхности, полученные на первой стадии описанной вышепроцедуры получения сферических поликатионных щеток (см. Экспериментальнуючасть). Добавление липосом с ν = 0.1 к суспензии таких микросфер сопровождалосьуменьшением заряда последних, что указывало на связывание липосом с поверхностьюмикросфер. Однако параллельно с комплексообразованием мы регистрировали заметноевозрастание электропроводности, которое, очевидно, было следствием появления50дефектов в адсорбированных липосомах и вытекания раствора NaCl.

Этот результатдемонстрирует принципиальное различие в поведении анионных липосом, связанных сдвумя типами катионных полимерных микросфер: разрушение липосом при ихадсорбции на «жесткой» катионной поверхности «традиционных» полимерныхмикросфер и сохранение их целостности при адсорбции на поверхности с привитымикатионными цепями. В последнем случае разрушению липосом препятствуетгидрофильныйслойпривитыхмакромолекул,которыйпредотвращаетнепосредственный контакт иммобилизованных липосом с твердой поверхностьюполистирольного ядра.Таким образом, можно сформулировать физикохимические свойства комплексовполикатионных щёток с анионными липосомами необходимые для их использования вкачестве носителей для доставки лекарственных веществ.

С одной стороны,взаимодействия между поликатионными щётками и анионными липосомами должныбыть достаточно сильными, чтобы комплексы были устойчивы при физиологическихзначениях ионной силы. С другой – при их взаимодействии не должно происходитьразрушения липосомальной структуры. Для липосом, содержащих в качестве анионногокомпонента кардиолипин, диапазон доли отрицательно заряженного липида с учетомприведенных выше условий лежит в пределах от 0.1 до 0.3.ДляполучениядополнительнойинформацииоморфологиикомплексовСК+/липосома был использован метод криогенной трансмиссионной электронноймикроскопии (крио-ТЭМ). Этот метод был специально разработан для анализаморфологии «мягких» объектов,втомчисле липосом,которые могутсущественно менять размер и форму при высушивании образца, что неизбежнов традиционных вариантах электронной микроскопии.

На Рис. 13а показанатипичная микрофотография поликатионной щетки в водно-солевом буферномрастворе;привитыеполикатионныецепивиднынаэтомрисункебездополнительного контрастирования. Электронная микрофотография липосом(Рис. 13б) подтверждает их моноламеллярную структуру; полученный этим51методом средний размер липосом (50±10 нм) согласуется с приведенными вышеданными динамического светорассеяния.

Частицы комплекса СК+/липосомаизображены на Рис. 13в. Каждая частица состоит из одной поликатионной щётки,окруженной несколькими липосомами. Рисунок ясно показывает сохранениесферической формы липосом (то есть целостности липосом) после ихсвязывания со щетками.аб50 нмв50 нмC50 нмРис. 13. Крио-ТЭМ изображения СК+ (1), ФХ/КЛ2- липосом (2) и комплекса СК+/липосома (3). Дляприготовления образцов использованы 1.5 мг/мл суспензия СК+ (1), 0.1 мг/мл суспензия липосом (2) исмешанная суспензия, содержавшая 1.5 мг /мл СК+ и 0.1 мг/мл липосом (3).4.1.2. Комплексы с участием ФС1-/ФХ липосом.Ранее было показано, что целостность анионных липосом в комплексе слинейными катионными полимерами определяется – среди прочего – геометрическойформой анионного липида (см., например, [136]).

Таким образом, главной причинойобразования дефектов в мембране ФХ/КЛ2- липосом с ν = 0.4 в комплексе с СК+,является геометрическая форма анионного липида (усечённый конус, в отличие отциллиндрической формы ФХ). СК+ вызывают в липосомальной мембране латеральнуюсегрегацию и флип-флоп анионного липида. Это обусловлено электростатическимвлиянием положительного заряда щёток и КЛ2- оказывается стянутым в отдельную фазуа, из-за различия в геометрии этого липида и ФХ происходит деформация мембраны награнице фаз КЛ2-–ФХ.Чтобы избежать деформации липосомальной мембраны при взаимодействиилипосом с высоким содержанием анионного липида с СК+, в качестве отрицательно52заряженного компонента мы использовали фосфатидилсерин (ФС1-).