Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 6

К заранее приготовленным27протеолипосомам, содержащим липид с реакционной группой, ковалентно пришивалифункционализированныелипосомыолигонуклеотиды.иммобилизовалинаТакиеподложку измодифицированныелипидногобислоя,липосомысодержащегонуклеотиды с комплементарной последовательностью. Иммобилизованные такимспособом липосомы сохраняют свою целостность, при этом сохраняя способностьдиффундировать в плоскости подложки. Главным недостатком этого способа являетсянеобходимость введения реакционноспособного липида на стадии приготовленияпротеолипосом, что ограничивается рядом факторов: протекание побочных реакций сбелками, отсутствие контроля за количеством «связавшихся» олигонуклеотидов. Былипредприняты попытки к усовершенствованию данной методики путем использованияамфифильных олигонуклеодитов, встраивающихся в липидный бислой при мягкихусловиях [103]. Однако оба этих способа предполагают проведение достаточно сложныхпроцедур предварительной модификации как липосом, так и поверхности.2.3.

Комплексы полиэлектролитов с противоположно заряженнымилипосомамиОтчасти описанные выше недостатки удалось устранить используя комплексылипосом с линейными полиэлектролитами.Взаимодействие синтетических полиэлектролитов с поверхностью клеток имодельных объектов – бислойных липидных мембран (БЛМ) является предметоминтенсивного исследования на протяжении последних 40 лет [104;105;106;107]. Какизвестно, поверхность большинства клеток несет суммарный отрицательный заряд,поэтому интерес исследователей, в основном, был сконцентрирован на изученииповедения поликатионов на поверхности БЛМ с включенными анионными липидами.Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозированиявозможных последствий контакта полиэлектролитов с клеточной поверхностью.По своему характеру взаимодействие между полимером и липосомами,состоящими из липидов или ПАВ имеет ту же природу, что и образованиеинтерполиэлектролитныхвзаимодействия.комплексов.Возможнонескольковариантовразвития282.3.1.

Взаимодействия между полимером и липосомами2.3.1.1. Электростатические взаимодействияДвижущий силой взаимодействия является энтропийный выигрыш свободнойэнергии,которыйдостигаетсяблагодарявысвобождениюнизкомолекулярныхпротивоионов полимера и липосом. Примером такого взаимодействия может служитьсистемаполикатионполи-N-этил-4-винилпиридинийбромид(ПЭВП)–везикулы,состоящие из яичного лецитина (ЯЛ) и отрицательно заряженного кардиолипина (КЛ 2-).В этом случае адсорбция сопровождается снижением заряда липосом до точкинейтрализации, после чего происходит перезарадка поверхности в результате адсорбцииизбыточного количества поликатиона [71;108].

На образование и диссоциациюкомпексов этого типа можно влиять, изменяя концентрацию солей. Комплекс ПЭВП–КЛ2-/ЯЛ липосом может полностью диссоциировать в растворах хлорида натрия придостижении концентрации соли порядка 0.2 М [71]. Контролировать образование идиссоциацию комплекса можно изменяя рН, что приводит к протонированиюотрицательно заряженного липида и снижает количество эффективного заряда наповерхностилипосомы.Другимспособомявляетсявведениепротивоположнозаряженного полиэлектролита, взаимодействие с которым предпочтительнее дляполикатиона по сравнению с адсорбцией на липосоме.

Причиной этого являетсяобразование большего количества контактов, и, как следствие, увеличение энтропии всистеме поликатион-полианион. Все эти способы активно используются для удалениябелков с поверхности положительно заряженных липосом [109;110].2.3.1.2. Гидрофобные взаимодействияЭтот тип комплексообразования наиболее эффективен, поскольку проникновениесегментовмакромолекулвнутрьлипидногобислояприводиткобразованиюкомплексов, устойчивых в солевых растворах [111;112]. Гидрофобная модификацияполимеров приводит к улучшению взаимодействия с липосомами различного состава,при этом гидрофобное взаимодействие даже превалирует над электростатическимотталкиванием. Хотя наибольшая стабильность обеспечивается длинными алкильнымихвостами, образование стабильных комплексов может наблюдаться и для короткихалкильных групп (например, этила) в случаях высокой плотности макромолекулы налипосомах, что реализуется для сетчатых полиэлектролитов [109;113].292.3.1.3.

Образование водородных связейТакого сорта взаимодействия были выявлены между липосомами и белкамитранслоказами, что продемонстрировано на фосфатидилхолиновых липосомах [114].Также предполагается, что образование водородных связей является движущей силойадсорбции поли(N-изопропилакриламид-глицидилакриламида) на поверхность липосом,содержащих полиэтиленгликоль (ПЭГ) [110;111].2.3.2. Структурные прерстройки в липидном бислое, вызываемые адсорбциейполикатионаАдсорбированныйлипосомальнойполимермембране.можетТаквнарушатьраспределениемембране,состоящейлипидовизвсмесидипальмитоилфосфохолина и кардиолипина, находящейся в жидком фазовом состоянии,липиды распределены равномерно. Методом микрокалориметрии было показано, чтоадсорбированныйполикатионспособенвызыватьлатеральнуюсегрегациюотрицательно заряженных липидов (образование кластеров) во внешнем слое липидов[115].

Так же некоторые поликатионы, например поли-N-этил-4-винилпиридинийбромид (ПЭВП), способны индуцировать флип-флоп липидных молекул. Отрицательнозаряженный липид перемещается из внутреннего слоя мембраны на внешний, а егоместо занимает электронейтральный липид. Таким образом, в комплексе реализуетсямикрофазовое разделение. При добавлении избытка поликатиона весь отрицательнозаряженный липид оказывается во внешнем слое мембраны, в то время как внутреннийслой формируется только электронейтральными липидами [116]. Образующаясяасимметрия липидного бислоя сохраняется только в присутствии адсорбированногополикатиона.

Удаление полимера с поверхности приводило к восстановлениюравномерного распределения липидов во внешнем и внутреннм слоях липосом. Стоитотметить, что индуцированные полимером перестройки в липидных мембранахпроисходили в течение нескольких секунд, в то время как обратный процесс занималоколо часа.На способность поликатионов вызывать структурные перестройки в липидноймембране после адсорбции влияют: фазовое состояние мембраны – в гелеобразномсостоянии индуцированных фазовых перестроек не наблюдается; длина цепиполкатиона – молекулы ПЭВП со степенью полимеризации меньше 30 не вызывали30флип-флоп, но вызывали латеральную сегрегацию; природа полимера – поли-L-лизин невызывает флип-флопа, вызывая латеральную сегрегацию.

В то же время стоит отметить,что при этой степени полимеризации поликатион утрачивал способность образовыватьпетли и хвосты, адсорбируясь на поверхность [115;117]. На ряде полиамфолитов наосонове поли-4-винилпириина, алкилированного бромкарбоновыми кислотами сразличным числом метиленовых групп, было показано, что длина с уменьшениемметиленовой развязки между атомом азота и карбоксильной группы с четырех до двухатомов приводит к последовательному исчензновению у полимеров вызывать флипфлоп, латеральную сегрегацию. Полиамфолит с одной метиленовой группой и вовсе невзаимодействует с отрицательно заряженными липосомами [118].2.3.3. Обратимость взаимодействия поликатионов с отрицательнозаряженными липосомами.Вслучаеэлектростатическойадсорбцииполикатионовнаотрицательнозаряженные малые липосомы удалить поликатион с поверхности липосомальноймембраны можно двумя способами.

Увеличение ионной силы раствора путем введениянизкомолекулярного электролита приводит к компенсации энтропийного выигрыша отобразования комплекса полимер-липосома, что в свою очередь ведет к десорбцииполимера [110]. Другой способ состоит в добавлении к комплексу поликатионотрицательно заряженная липосома избытка (по заряженным группам) полианиона. Врезультате конкурентных реакций в растворе появляются свободные липосомы иинтерполиэлектролитный комплекс, несущий избыточный отрицательный заряд.Комбинаторная энтропия образующейся системы выше, чем для смеси комплексаполикатион-липосома и свободного полианиона [119]. Описанное выше справедливодля случая, когда мембрана находится в жидкокристаллическом состоянии [75].Адсорбция поликатиона может быть и необратима.

Так наличие в полимерегидрофобных групп обеспечивает необратимость адсорбции, за счет их встраивания вгидрофобную область бислоя (область хвостов липидов) [120]. При адсорбцииполикатиона на большие липосомы цепь полимера способна заглубляться в бислоймембраны больших липосом обладают спонтанной кривизной, что приводит кобразованияю временных дефектов в мембране, куда и заглубляется поликатион [108].31Дальнейшее увеличение размеров липосом приводит к тому, что поликатион можетпроникать во внутренний объем липосомы через мембрану [121].Адсорбцияполикатионанамебранылипосом,находящихсявтвердомгелеобразном состоянии, необратима, т.к. в таких мембранах после адсорбции полимерапоявляется множество дефектов, куда заглубляется поликатион [122].Поликатион спосбен вызывать не только нарушение целостности липосомальноймембраны, но и даже ее разрушение [123].

Влияние поликатиона на целостностьлипосомальной мембраны зависит от содержания анионного липида. Так, для липосом ссодержанием КЛ2- 0.45 и выше наблюдается 100% вытекание низкомолекулярной солипри добавлении линейного полэлектролита. Более того, при добавлении линейнойполиакриловой кисоты к полученным комплексам не наблюдалось разрушениякомплекса липосома-поликатион, что говорит о разрушении липосомальной структурыи образовании стабильного невезикулярного комплекса липид-поликатион.2.3.4. Механизмы агрегации липосом под действием адсорбированногополиэлектролитаАдсорбцияполиэлектролитанаповерхностизаряженныхлипосомсопровождается агрегацией частиц. Выделяют два режима агрегации, которыепротекают параллельно друг другу [124].

Оба режима являются результатомструктурных особенностей участников взаимодействия и кинетически зависимы.Для первого режима, который получил название «структурный» лимитирующейстадией является диффузия липосом и макромолекулы в агрегат. Этот режимреализуется при недостатке поликатиона, то есть до точки электронейтральностикомплекса. Процесс адсорбции сопровождается деструкцией воды приповерхностногослоя липосом, нейтрализацией заряда липидов и внесением новых зарядов в системуполикатионом. В результате липосомы теряют свою коллоидную стабильность за счетснижения стабилизирующих потенциалов, что приводит к агрегации липосом.