Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства (1105582), страница 8
Текст из файла (страница 8)
об/мин и использовали в течение 3 суток.Малые моноламмелярные липосомы из ДПФХ и ПОФС готовили аналогичнометодике, описанной выше, проводя отгонку растворителя и озвучивание притемпературах Т = 55 °С и Т = 65 °С соответственно.Также в работе использовали липосомы, содержащие 0.1 анионного липида ивключающие третий компонент – липид-переключатель ДОП. Для формирования такихлипосом в процессе смешения растворов липидов часть нейтрального липидазаменялась на ДОП таким образом, чтобы мольное соотношение липидов былоследующим: ПОФС/ДОП/ФХ = 1/3/6.3.2.2. Получение флуоресцентно меченных липосом, липосом, содержащихДИЛ и липосом, наполненных солью и лакмусомДля получения меченных липосом в процессе формирования липидной пленки ксмеси растворов липидов добавляли раствор, содержащий флуоресцентно меченыйлипид (0.05 масс.
% от общего содержания липидов).39Для формирования липосом, содержащих ДИЛ в области гидрофобных хвостов, впроцессе формирования липидной пленки к смеси растворов липидов добавляли растворДИЛ в хлороформе, содержащий 0.8 масс. % ДИЛ от общего содержания липидов.Во время приготовления липосом поддерживалась постоянная температурараствора. Температура подбиралась таким образом, чтобы в процессе приготовления всекомпоненты находились при температуре выше фазового перехода, т.е. в «жидком»состоянии.При получения липосом, наполненных лакмусом или солью, к сформированнойлипидной пленке вместо буферного раствора добавляли раствор лакмуса или соли (1 М).Время озвучивания было увеличено до 900 секунд. Затем проводили диализ: в течениесуток в случае наполненных лакмусом липосом (в буре с концентрацией 10 -3 М), и втечение полутора часов – для наполненных солью (45 минут в дистиллированной воде,затем 45 минут в буфере ТРИС с концентрацией 10-3 М).3.2.3.
Получение полипетидных везикул.Полипептидные везикулы получали способом, описанным ниже. В эпендорфпомещали 5 мг блочного полипетида, добавляли 125 мкл тетрагидрофурана (ТГФ),встряхивали на встряхивателе Vortex до образования кашеобразной массы и озвучивалив бане в течение 300 с. Далее добавляли 125 мкл буфера и процедуру встряхивания иозвучивания повотряли до образования прозрачного раствора. Затем добавляли краствору 4×62,5 мкл ТГФ, после каждого добавления растворителя образец встряхивали.В конце раствор озвучивали в ультразвуковой бане. Полученные везикулы диализовалипротив буфера в течение 24 часов со сменой буфера через два часа после началадиализа. Размер полученных таким способом везикул колебался в диапазоне 200-600 нм.Концентрацию заряженных групп определяли титрованием.3.3. Методы исследования.3.3.1.
Динамическое светорассеяниеГидродинамический диаметр (размер) липосом, полипептидных везикул и ихкомплексов оценивали с помощью прибора Brookhaven 90 Plus (Brookhaven InstrumentsCompany, США) при фиксированном угле (90°).403.3.2. Электрофоретическая подвижностьЭлектрофоретическаяподвижностьлипосомиихкомплексовсполиэлектролитами была измерена с использованием лазерного микроэлектрофореза наприбореBrookhaven90Plus(BrookhavenInstrumentsCompany,США)втермостатируемой ячейке по стандартной методике, предложенной производителем.3.3.3. ФлуориметрияИзмерение интенсивности флуоресценции растворов липосом проводили наспектрофлуориметре F-4000 (Hitachi, Япония).
Использовали кюветы шириной 1 см.Измерения проводились в термостатируемой ячейке.3.3.4. СпектроскопияАналитическое определение концентраций липосом, содержащих лакмус и ДИЛ,в растворе проводили методом спектроскопии на спектрофотометре UV-Mini (Shimadzu)по характеристическим полосам поглощения. Для этого измеряли оптическуюплотность растворов различной концентрации при длине волны λ = 586 нм для липосом,содержащих лакмус во внутреннем объеме, и λ = 551 нм для липосом, содержащих ДИЛв области гидрофобных хвостов, в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1.0 см.3.3.5. КондуктометрияИзмерение электропроводности растворов проводили на кондуктометре CDM 83Radiometer (Дания). Для измерений использовали полиэтиленовую кювету, объем пробысоставлял 1 мл.3.3.6.
Препаративное центрифугированиеПри приготовлении липосом осаждение металлической пыли проводилось нацентрифуге “J-11” фирмы “Beckman”(Австрия). Время и скорость вращения роторавыбирали таким образом, чтобы при ультрацентрифугировании не происходилоосаждения водорастворимых компонентов системы.ДляотделенияБСМотраствораиспользовалосьцентрифугирование(6000 об/мин.), которое проводилось на центрифуге Galaxy Mini (VWR International,США).41Дляосажденияиспользовалоськомплексовцентрифугированиекатионных(18000везикулоб/мин.),ианионныхкотороелипосомпроводилосьнацентрифуге “J2-21” фирмы “Beckman”(Австрия) в течение 40 минут под вакуумом.3.3.7.
ПотенциометрияИзмерения pH растворов проводились на pH-метре pH-210 фирмы “Hanna”. Вкачестве измерительного электрода использовался стеклянный электрод для измеренияpH марки HI 1131B. Перед каждым измерением прибор калибровали по стандартнымбуферным растворам с pH = 4.01 и pH = 7.01. Точность определения pH растворовсоставляла 0.01 ед. pH.3.3.8. Криогенная трансмиссионная электронная микроскопияОбразцы для криогенной трансмиссионной электронной микроскопии готовили вспециализированной камере, в которой поддерживалась желаемая температура ивлажность.
Капля суспензии липосом или комплекса липосом с полимером наносиласьна медную сетку, покрытую перфорированной углеродной пленкой. Избыток суспензииудаляли фильтровальной бумагой. Затем образец погружали в жидкий этан,находящийся при температуре замерзания.
Обезвоженный таким образом образецпомещали в охлаждающую ячейку Oxford CT-3500 и исследовали в трансмиссионномэлектронном микроскопе Philips CM 120 при температуре -180 °C в режиме малых дозэлектронных пучков, чтобы предотвратить радиационное повреждение образца.Изображения оцифровывали и записывали на компьютер с помощью камеры Gatan 791MultyScan CCD camera [134].3.3.9.
Дифференциальная сканирующая калориметрияИсследованиямикрокалориметриифазовыхнапереходоввдифференциальномлипосомахпроводилиадиабатномметодомсканирующеммикрокалориметре ДАСМ-4 (Специальное бюро биологического приборостроения приРоссийской академии наук, СССР). Калориметрический узел данного прибора содержалдве калориметрические камеры, идентичные по массе и объему, окруженные двумяконцентрическими адиабатирующими экранами и термостатом.
Калориметрическаякамера представляла собой капилляр, согнутый в цилиндрическую спираль с внешнимдиаметром 1.6 мм (объем 0.4659 мл). Разность тепловых мощностей компенсировалась42электрическим путем. Калибровочная мощность составляла 25×10-6 Вт. В камере былосоздано избыточное давление для исключения погрешностей, связанных с выделениемгаза или кипением. Исследуемые образцы прогревали со скоростью 1 °С/мин втемпературном интервале 20-55 °С.3.3.10.
Прижизненное окрашивание клеток метилтетразолевым синимДля оценки цитотоксичности полипептидных везикул и их комплексов слипосомами использовали MTT-тест, основанный на способности митохондриальныхдегидрогеназ и эстераз конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) жёлтого цвета в пурпурный формазан, которыйкристаллизуется внутри клетки.Формазан образуется только в живых клетках, и его количество позволяетрассчитать процент выживших клеток от их общего числа после добавления какоголибо реагента. К монослойной культуре добавляли раствор реагента в сывороткеDMEM, содержащей соли, аминокислоты и витамины, необходимые для жизни иразмножения клеток.
Количество клеток во всех экспериментах было одинаковым, иплотность засева составляла около 70% от общей площади ячейки. Раствор реагентавыдерживали с клетками в течение 1 часа, добавляли МТТ, и инкубировали клетки втечение еще 1 часа. Затем удаляли верхний слой жидкости, и переводили формазан враствор добавлением при помощи ДМСО. Раствор фотометрировали при длине волныλ = 550 нм. Сопоставляя изменение оптической плотности раствора по отношению кконтролю, определяли количество формазана в каждой пробе.4.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ4.1. Комплексы поликатионных щёток с анионными липосомами4.1.1. Комплексы с участием КЛ2-/ФХ липосомЗа взаимодействием анионных липосом, содержащих в качестве отрицательнозаряженного компонента кардиолипин, со сферическими поликатионными щёткамиследили по изменению поверхностного заряда частиц. На Рис. 6 представленызависимости электрофоретической подвижности (ЭФП) комплексов от концентрациилипосом, добавленных в систему. Образование комплексов поликатионных щеток с43липосомами с ν = 0.05 (кривая 1) сопровождается уменьшением заряда частицы,который достигает нулевого значения при Слипосом = 0.88 мг/мл. Данная концентрациясоответствует 10-4 М анионных липидов, что эквимольно концентрации положительныхзарядов в системе.
Дальнейшее добавление липосом приводит к перезарядкеповерхности комплексов. Увеличение доли анионного липида в липосомах приводит куменьшению количества липосом требуемого для нейтрализации заряда щёток. Причёмколичество отрицательно заряженного липида в нейтральном комплексе остаётсяэквимольнымколичествуположительнозаряженныхгруппщёток.Величинамаксимального отрицательного значения ЭФП зависит от доли кардиолипина вмембране и растёт по мере увеличения отрицательного заряда липосом. Так длякомплексов с липосомами с долей анионного липида 0.05 перезарядка практически непроисходит и значение ЭФП держится на значениях близких к нулю (кривая 1), в товремя как для липосом с содержанием кардиолипина 0.3 и 0.4 (кривые 4 и 5) ЭФПЭФП, (мкм/c)/(В/cм)максимальное достигает -3 (мкм/с)/(В/см).3054321-30.51.01.5Cлипосом , мг/млРис.
6. Зависимость ЭФП частиц комплекса СК+-липосомы КЛ /ФХ от концентрации липосом.2-Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5). [СК+] = 1×10-4осново-моль/л; 10-2 М боратный буфер рН 9.2, 20 °С.44Параллельные измерения размеров частиц (Рис. 7) показали, что при начальномдобавлении суспензии липосом к поликатионным щёткам существенного изменениягидродинамического диаметра частиц не наблюдается. Затем, при достижении в системеотношения отрицательного заряда к положительному 1:2, размер частиц резко начинаетвозрастать и достигает своего максимума для нейтрального комплекса. Дальнейшеедобавление липосом приводит к уменьшению размеров и при избытке отрицательногоD, нмзаряда размеры частиц достигают ~400 нм.1.542351.010.50.40.81.2Cлипосом, мг/млРис.
7. Зависимость гидродинамического диаметра частиц комплекса СК+-липосомы КЛ2-/ФХ отконцентрации липосом. Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4),0.4 (5). [СК+] =1×10-4 осново-моль/л; 10-2 М боратный буфер рН 9.2, 20 °С..Для регистрации связывания анионных липосом с поликатионными щетками былиспользован метод флуоресценции. К суспензии СК+ добавляли суспензию ФИТЦмеченыхлипосом,СК+садсорбированнымилипосомамиотделяли45центрифугированиемиизмерялиинтенсивностьфлуоресценциисупернатантов,которую пересчитывали в концентрацию липосом, используя соответствующуюкалибровочную кривую.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
