Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства (1105582), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Такоймеханизм протекания процесса агрегации дает относительно мелкие частицы (100-500нм) по причине небольшой эффективности соударений между кластерами.Во втором механизме («цепной механизм») определяющим являются особенностистроения макромолекулы, в частности, подвижность сегментов.
Лимитирующей стадиейявляется благоприятная для образования контакта ориентация заряженных звеньев32полимера. Подобный режим характерен для полиэлектролитов высокой степениполимеризации, а также в диапазоне концентраций полимера вблизи и выше точкинейтрализации поверхностного заряда липосом. Механизм, как и в предыдущем случае,заключается в адсорбции сегментов макромолекулы на одну липосому. Отличие в том,что только часть звеньев адсорбируется на везикулы. Несвязанные сегменты способны,блуждая в растворе, адсорбироваться на другие липосомы. В результате протеканияпроцесса образуются частицы с микрометровым размером, эффективность соударенийкластеров выше, а также проявляется дополнительный эффект связывания полимера[125].2.3.5.
Стабилизация липосом от агрегации под действием поликатионаСтабилизации от агрегации в системе поликатион-липосома. можно добиться,создавая на поверхности комплекса «электростатический» барьер [71;108;124;125;126].Дополнительно к нему можно создать «стерический» барьер за счет введения ПЭГмодифицированного липида, что позволит повысить устойчивость липосом к агрегациии вклад «структурного механизма» агрегации будет нивелирован. С другой стороны,такая модификация не окажет сильного воздействия на агрегацию при «цепноммеханизме». Для создания «электростатического» барьера необходимо, чтобы впроцессе адсорбции поликатиона происходило увеличение положительного зарядакомплекса, что сможет предотвратить агрегацию. Авторы [127] утверждают, чтоиспользование везикул, содержавших положительно и отрицательно заряженныелипиды в равном соотношении, позволяет стабилизировать образующийся комплекс.2.3.6.
Влияние адсорбции полиэлектролитов на липосомы на скорость трансмембранного транспорта низкомолекулярных веществВ работах [71;128;110;129] описывается ускорение транспорта соли (NaCl) идоксорубицина через липидную мембрану в результате адсорбции полиэлектролитов ибелков на противоположно заряженные липосомы. Было показано, что адсорбция ПЭВПнаанионныелипосомысопровождаетсяобразованиедоменовотрицательнозаряженного компонента, что приводит к образованию дефектов на границе доменов.Именно в местах дефектов и происходит образование пор [71]. С другой стороныполиэлектролиты с подвижными сегментами способны образовывать петли.
Врезультате взаимного отталкивания петель ускоряется «флип-флоп» липидов, снижается33латеральное давление в бислое, и уменьшается плотность гидрофобной его части, чтоприводит в конечном счете к повышению проницаемости мембран.2.3.7. Взаимодействие комплексов анионные липосомы-поликатион склеткамиВ ходе недавних исследований было показано [130], что использованиекомплексов анионных липосом с поликатионом не только существенно уменьшаеттоксичность поликатиона (токсичность комплексов липосом с поликатионом близка ктоксичности самих липосом), но и увеличивает афинность таких комплексов к клеткампо сравнению с обычными липосомами.
Было показано, что добавление к клеткамлинии HeLa липосом, заполненных Докс (противоопухолевый препарат на основедоксорубицина), приводило к появлению яркой флуоресценции только на поверхностиклеток. В то же время, замена липосомальных контейнеров на содержавшие Докскомплексы липосом с поликатионом (нанокапсулы) сопровождалась появлениемфлуоресценции в ядрах клеток. Причем этот эффект усиливался по мере увеличенияколичества адсорбированного на липосомальной мембране поликатиона. Нанокапсулы ссуммарным положительным поверхностным зарядом обеспечивали проникновение вклетки большего количества Докс, чем нанокапсулы с суммарным отрицательнымзарядом. Также было показано, что добавление липосом, заполненных Докс, к клеткам смножественной лекарственной устойчивостью не приводит к попаданию препаратавнутрь клетки, тогда как использование положительно заряженных комплексовполикатион–липосомаспособствуетпроникновениюДоксвнутрьклетки.Исследование токсичности таких комплексов на мышах показали, что данныекомплексы не оказывают токсического действия.Из литературного обзора следует, что модификация липосом линейнымиполиэлектролитами позволяет существенно улучшить их физикохимические свойства иупрощает возможность использования таких конструкций в биомедицинских целях.Однако, ряд вопросов остается нерешенным.
Так, при использовании таких конструкцийневозможно контролировать количество адсорбированных липосом, а также получатьсистемы с разнозаполненными липосомами в заданном соотношении. При модификациианионныхлипосомлинейнымиполкатионаминаблюдаетсянеконтролируемая34аггрегация частиц. Также к недостаткам таких систем можно отнести способностьлинейных поликатионов разрушать липосомальную мембрану.В данной работе представлен способ устранения перечисленных вышенедостатков полимер-липосомальных наноконтейнеров путем замены линейногополикатиона на катионные частицы отличной структуры – ядро с привитыми на негокатионными цепями. Кроме того рассмотрен способ получения мультилипосомальногоконтейнера, способного к высвобождению содержимого при изменении рН среды.353.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.3.1. Используемые реагенты.3.1.1. Фосфолипиды и ПАВ.Кардиолипин(КЛ),растворпальмитоилолеоилфосфатидилсеринвэтанолесконцентрацией25(ПОФС); диолеоилфосфатидилхолинмг/мл;(ДОФХ);дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ); дипальмитоилфосфатидилсерин (ДПФС);липиды фирмы Avanti Polar Lipids; меченый флуоресцеин-изоцианатом (ФИТЦ,C12H11O5NS) дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (ДПФЭ-ФИТЦ) фирма “Sigma”(США),тритонХ-100“Sigma”(США),липидоподобныйдидодецилоксикарбонил-2-морфолиноциклогексанол(ДОП),ПАВтранс-4,5обладающийконформационным переходом, синтезирован по методике [131].
Все липиды и ПАВиспользовали без дополнительной очистки.3.1.2. Полимеры.Сферические поликатионные щетки (СК+) синтезировали по методике [132]графт-полимеризацией триметиламиноэтилметакрилатаммоний хлорида на поверхностимонодисперсных полистирольных латексных частиц с диаметром 100 нм [133]. Среднеечисло поликатионных цепей на частицу составляло 600, средняя длина цепей – 65 нм.Концентрация CК+ приведена в молях кватернизованных звеньев в литре раствора.Блок-сополимер полиаргинина (длина блока х = 60 мономерных звеньев) иполилейцина (длина блока y = 20 мономерных звеньев) R60L20.3.1.3.
Низкомолекулярные реактивы.В работе использовали хлороформ (CHСl3), метанол (CH3OH), тетрагидрофуран(ТГФ) марки х.ч. “Реахим ” (Россия) без дополнительной очистки, раствор этанола(C2H5OH) с концентрацией 95 % “Ферейн” (Россия).Буфер ТРИС с pH = 7 и pH = 8 готовили, используя трис (трис-(гидроксиметил)аминометан) марки х.ч., “Реахим ” (Россия).Буферные растворы с концентрацией 10-2 М и 10-3 М готовили по навеске, рНполученных растворов определяли на рН-метре фирмы «Hanna».36Для приготовления 4М раствора хлорида натрия использовали NaCl марки х.ч.“Реахим” (Россия) без дополнительной очистки.Для приготовления липосом, содержащих гидрофильный краситель, использовалираствор лакмуса “Ferak” (Берлин) в буре (буферный раствор концентрацией 10-2 М,рН = 9,2) с начальной концентрацией 0.05 г/мл, который затем два раза фильтровали спомощью фильтра, диаметр пор которого составлял 450 нм.Для приготовления липосом, содержащих гидрофобный краситель, использовалираствор 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат (ДИЛ) вхлороформе концентрацией 1.67 мг/мл.Для приготовления буферного раствора с рН = 5 использовали ацетатный буфер.3.1.4.
Вода.Воду очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему“Milli-Q” фирмы “Миллипор” (США), включающую ионооюменные, адсорбционныеколонки для глубокой очистки от органических примесей и фильтры для удалениякрупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность0,56 μs/см.3.1.5. Стркутурные формулы используемых веществФосфатидилхолин:1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфо-L-серин:371,2-диолеоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(1-пиренсульфонил) (аммонийнаясоль):1,2-диолеоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(карбоксифлуоресцеин) (ДОФЭАКФ):Транс-3,4-дигидроксипиперидин (ДОП):OONOOOHOТритон Х-100:OOHnn = 9-10Блок-сополимер аргинина с лейцином:OHBr N HHNHHNxNHHNNH2Лакмус:ONHOOOHNyH381,1-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорат (ДИЛ):HC C CH HN(CH 2)17CH 3N(CH2 )17CH33.2.
Объекты исследования.3.2.1. Получение липосом.Малые моноламеллярные липосомы получалиметодом озвучивания [9].Расчётное количество растворов липидов смешивали и тщательно удаляли органическийрастворитель на вакуумном роторном испарителе “Rotovapor” фирмы “Buchi”(Швейцария) при температуре Т = 36 °С и скорости вращения 90 об/мин.Образующуюся тонкую плёнку липидов диспергировали в необходимом количествебуфера.
После этого на препарат воздействовали ультразвуком частоты 22 кГц в течение600 с (2×300 с) в непрерывном режиме при постоянном охлаждении водой.Использовали ультразвуковой диспергатор 4710 (фирма “Cole-Parmer Instrument”,США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге в течение 5минут при скорости 13 тыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
