Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства (1105582), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Стоит отметить, что при малых значенияхККМ свободная энергия уменьшается, т.е. высоко гидрофобные молекулы стараютсяагрегировать при меньших концентрациях.Таким образом, для образования бислоя необходимо, чтобы липид можно былопредставить в виде цилиндра, у которого площадь полярной головы почти совпадает сплощадью углеводородных хвостов, при этом вещество должно иметь низкое значениеККМ.Образование заполненных растворителем сферических липидных везикул, илилипосом, происходит самопроизвольно. Прямые контакты краев бислоя с водойэнергетически не выгодны, поэтому и происходит замыкание бислоя в сферы, чтоустраняет этот краевой эффект.
Движущей силой процесса является увеличениеэнтропии в результате образования из одного плоского бислоя нескольких везикул [7;8].122.1.3. ЛипосомыЛипосомыпредставляютсобойколлоидныеобразования,состоящиеизнебольшого объёма водной фазы, отделённой от объёма раствора замкнутым липиднымбислоем. Многие фосфолипиды при диспергировании в воде самопроизвольно образуютгетерогенную смесь везикулярных структур, состоящих из нескольких бислойныхконцентрическихоболочек.Такиелипосомыназываютсямультиламеллярнымивезикулами (МЛВ). Большой интерес представляют моноламеллярные везикулы, т.е.везикулы, образованные одинарным бислоем.
При получении липосом возможноконтролировать их внутреннее содержимое, состав бислоя и его кривизну (размерлипосом).Обычно липосомы разделяют на малые (d~200÷500Å), большие (d~500÷5000Å) игигантские (до 300 мкм). Из них наибольший для исследователя интерес представляютмалые моноламеллярные везикулы (ММВ).Малые моноламеллярные везикулы можно получать несколькими способами:ультразвуковая обработка водных дисперсий фосфолипидов, быстрое введениеэтанольного раствора липида в водную фазу, а также метод экструзии.НаиболееширокоиспользуемымметодомполученияММВявляетсяультразвуковая обработка водных суспензий мультиламеллярных липидных везикул.Так как во время процесса везикулы полностью разрушаются и образуются заново,начальный размер и ламеллярность везикул не имеют значения.
Существует два методаультразвуковой обработки: а) с использованием щупа, б) обработка в ультразвуковойбане. Первый метод применяется для суспензий с высокой концентрацией липида илидля получения систем с высокой вязкостью. Второй метод применим для получениябольших объёмов разбавленного липида.Озвучивание при помощи щупа. Для наиболее эффективного проведения процесса,целесообразно проводить озвучивание в круглодонной пробирке с диаметром лишьнемного превосходящем диаметр щупа.
Щуп должен быть погружён в суспензиюлипида не более чем на 4 мм и не должен касаться стенок пробирки. Из-за выделениятепла во время озвучивания пробы, существует риск окисления липида. Чтобы избежатьэтого, дисперсию липида следует охлаждать во время процесса озвучивания.Озвучивание в бане.
Этот метод получения ММВ более мягкий, чем озвучиваниепробы при помощи щупа, и риск окисления липида в этом методе невелик. Объём пробы13при озвучивании в бане намного больше, а температурный контроль необязателен. Прииспользовании этого метода невозможно получить липосомы минимального размера.Даже после длительной процедуры озвучивания, полученная суспензия не будетгомогенна по размерам липосом. Поэтому для опытов, где распределение липосом поразмерам играет большую роль, получение ММВ этим способом неприменимо.Экструзию липосом чаще всего проводят при помощи пресса Френча.
При этомобразуется гомогенная смесь моно- и олиголамеллярных везикул со средним размеромоколо 30-80 нм (в зависимости от используемого давления). Данный метод используетсядля получения липосом, с включёнными в них чувствительными к физико-химическимвоздействиям молекулами (ферментами). Процесс экструзии следует проводить притемпературе выше, чем температура фазового перехода мембранного липида, в то жевремя систему следует охлаждать, чтобы избежать окисления липидов или уменьшенияактивностибиологическихмолекул,входящихвсоставмембраны.Размерполучающихся везикул зависит от липидного состава, температуры, и, что наиболееважно, от используемого давления. Липосомы, полученные таким способом, хоть иявляются ММВ, но всё же больше, чем везикулы, полученные при помощиультразвукового озвучивания, однако, такие липосомы более стабильны.
[9]2.1.4. Упаковка ацильных хвостов в липидном бислоеДля липидных систем характерен полиморфизм фазовых состояний. Взависимости от условий (липидный состав, температура, ионная сила, рН) в нихвозможно существование разных фаз.Для бислойных мембран, состоящих из диацилфосфолипидов, можно выделитьчетыре фазы: три кристаллические фазы Lβ, Lc., Pβ и одну жидкую фазу Lα (Рис. 3).14Рис.
3. Схематичное представление упаковки липидных молекул в липидном бислое для разных фазовыхсостояний.2.1.4.1. Кристаллические фазы Lβ, Lc и их основные характеристикиLβ – гелевая фаза, в которой углеводородные цепи расположенные параллельнодруг другу под углом 30-32° к нормали бислоя, образуют гексагональную решетку [5].Цепи из внутреннего монослоя параллельны цепям из внешнего монослоя.Основная причина отклонения от нормали липидных молекул по обе стороныбислоя заключается в поведении гидрофобных хвостов. В пользу этого говорятрезультаты работы [10], в которой было показано, что существующие взаимодействиямежду соседнимимолекулами липидов, обусловленныеобразованием диполь-дипольных контактов, солевых и/или водородных связей между головами, не изменяютплощадь головы (Г) с увеличением температуры (коэффициент термическогорасширения (αA ≈ 0.0003/°C).
Голова липида имеет постоянную площадь A, большеудвоенной площади углеводородных цепей Ас, что реализуется при температурах нижефазового перехода. Для компенсации различий в площадях составных частей молекуллипидов фосфатидилхолинового ряда происходит наклон цепей на угол cosθ = 2A c/A[11] (см. Рис. 3).15В отличие от Lβ, Lc – характеризуется также упорядоченным расположениемлипидных молекул, с той лишь разницей, что молекулы расположены перпендикулярнонормали.Формированиетакойфазыхарактернодлялипидовфосфатидилэтаноламинового ряда [12]. Фосфоэтаноламин не содержит трех метильныхгрупп, площадь головы практически совпадает с площадью хвостов, и поэтомуформируется фаза, в которой соседние молекулы не наклонены.Плотная упаковка липидов в состоянии Lβ и Lc приводит к тому, что коэффициентлатеральной диффузии липидных молекул составляет величину порядка 10-3 мкм2/с, т.е.движение липидов относительно заторможено и составляет всего 0,1 нм/с [13].2.1.4.2.
Жидкая фаза Lα: основные характеристикиLα – молекулы липидов расположены перпендикулярно к плоскости бислоя,полярные головки остаются связанными между собой. За счет теплового движенияуглеводородных хвостов происходит взаимное отталкивание липидных молекул, чтоприводит к увеличению их общей площади. Так для дипальмитоилфосфатидил холина(ДПФХ) изменение температуры от 23°C (Lβ) до 50°C (Lα) приводит к увеличениюсуммарной площади молекулы от 70 до 77 Å2. [14]В тоже время, для ненасыщенных липидов взаимное отталкивание ацильныххвостов наблюдается в результате суперпозиции теплового движения и перехода из циск транс- конформеру ацильных хвостов. Для того же температурного диапазона, что идля ДПФХ, увеличение суммарной площади молекулы диолеилфосфатидилхолина(ДОФХ) составляет 17 Å2: с 68 в (Lβ) до 85 Å2 (Lα) [15].Коэффициент латеральной диффузии молекул в бислое составляет 1 мкм2/с, чтосоответствует скорости перемещения липидов 100 нм/сек [16].2.1.4.3.
Ребристая фаза, основные отличия.Большинство насыщенных фосфатидилхолиновых липидов имеют возможностьпереходить в промежуточную фазу, при температурах немного ниже температурыосновного перехода, с образованием ребристой фазы. Pβ – фаза характеризуется такжеперпендикулярным расположением липидов к поверхности бислоя, что и Lβ, но подуглом ~30° к локальной нормали (Рис.
3). Хотя причина образования ребер до конца неизучена, тем не менее предпринятые попытки исследования рентгеновским рассеянием,молекулярной динамикой и ЯМР указывают на то, что присутствует два типа16ориентации липидных хвостов – один полностью упорядоченный, сопоставимый поструктуре с гелем, другой – полностью разупорядоченный как в жидкой фазе [17;18;19].2.1.5.
Фазовые переходы в липидном бислое и факторы, влияющие натемпературу фазового переходаОсновной фазовый переход связан с переходом углеводородных цепей липидныхмолекул из состояния геля (Lβ) в состояние жидкого кристалла (Lα) [20;21;22]. В гельсостоянии все гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул вытянуты строгопараллельно друг другу (полностью находятся в транс-конформации), подвижностьлипидных молекул сильно ограничена. В жидкокристаллическом состоянии возможнаотносительновысокаямолекулярнаяподвижностькомпонентов:гидрофобныеуглеводородные остатки изгибаются, нарушается их параллельность, и мембрана вцелом ведет себя как жидкая, текучая фаза.Температура основного фазового перехода ( Tm ) зависит от многих факторов, втом числе от природы полярных головок, длины и степени ненасыщенностиуглеводородного радикала, силы взаимодействия между цепями, наличия холестерина вбислое [23;24;25].2.1.5.1.
Влияние природы полярной головки липидаСо стороны гидрофильных голов может проявляться стерическое отталкиваниесоседних молекул в бислое. Влияние взаимодействий между полярными головкамилипидов представлено на Рис. 4. При одинаковой длине ацильных хвостов температураплавления производных фосфотидилсерина на 15 °С выше по сравнению сфосфатидилхолинами в силу наличия отталкивания между группами триметиламинов. Сдругой стороны, приведенные данные для фосфатидилглицеролов (ФГ) полностьюсовпадают с липидами ФХ ряда. Принимая во внимание, что в голове ФГ присутствуютодновременно и отрицательный заряд от фосфатной группы, и пришитый к голове черезсложно эфирную связь остаток этиленгликоля, можно говорить, что при прочих равныхусловиях влияние стерических затруднений оказывает более выраженное воздействие наупаковку липидов в мембране по сравнению с зарядом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
