Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 13

Таким образом, иммобилизация на поверхностиСК+ анионных липосом позволяет понизить их цитотоксичность.4.6. Комплексы анионных липосом с полипептидными везикулами.Не смотря на относительно низкую цитотоксичность комплексов СК+/анионныелипосомы, их использование в биомедицинских целях вряд ли возможно и даннуюсистему можно использовать исключительно в качестве модельной. Одним из главныхминусов СК+ является то, что они небиоразлагаемы.

При замене СК+ другимполикатионом аналогичного строения, но являющегося биоразлагаемым мы ожидаем76сохранения основных физикохимических свойств, описанных выше для комплексовСК+/анионные липосомы: образование стабильных при физиологических значенияхионной силы комплексов без нарушения липосомальной структуры, с добавлениемсущественного плюса таким системам – биоразложимости.В качестве биоразложимого носителя мы использовали везикулы, состоящие изблочного полипептида, гидрофобный блок которого представлен полилейцином, акатионный – полиаргинином. Такие полипептиды образуют везикулы по своемустроению похожие на липосомы: катионные блоки полипептидов обращены наружу ивнутрь везикул.

Везикулы, полученные по методике, описанной в разделе 3.2.3,представляют собой смесь двух фракций различных по размеру везикул.В экспериментах по изучению свойств комплексов липосом с полипептиднымивезикулами мы использовали липосомы, содержащие в качестве анионного компонентафосфатидилсерин с ν = 0.1Было показано, что замена СК+ на полипептидные везикулы существенно невлияет на формирование комплексов с липосомами и физикохимические свойсва такихкомплексов. Полипептидные везикулы эффективно адсорбируют анионные липосомы(Рис. 29), комплексы являются стабильными при физиологических значениях ионнойсилы (Рис. 30), и липосомальная структура при адсорбции не нарушается (Рис.

31).Cлипосом в супернатанте, мг/мл770.40.20.00.40.81.21.6Cлипосом в системе, мг/млРис. 29. Зависимость концентрации ФС /ФХ липосом в надосадочной жидкости от общей1-концентрации липосом в системе. ν = 0.1; [R60L20] = 1×10-4 осново-моль/л; 10-2 М трис буфер, рН 7.0;20 ºСДанные, представленные на Рис. 29 хорошо согласуются с аналогичнымиданными для комплексов ФС1-/ФХ липосом с СК+ (Рис. 16, кривая 1).

Рассчётколичества липосом, адсорбированных на одну везикулу, является затруднительным изза наличия различных по размеру фракций.78Флуоресценция, о.е.1.000.900.800.700.00.20.40.60.81.01.21.4[NaCl], MРис. 30. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции комплекса полипептидныевезикулы/меченые липосомы ФС1-/ФХ от концентрации NaCl. Содержание анионного липида влипосомах ν = 0.1. Общая концентрация липидов 1 мг/мл; 10-2 М трис буфер, рН 7.0; 20 ºС.Как видно из Рис. 30, комплексы ФС1-/ФХ липосом с везикулами оказываютсястабильным к диссоциации на исходные компоненты при физиологической ионной силераствора. При дальнейшем увеличении ионной силы раствора происходит лишьчастичная диссоциация комплекса.

Наличие комплексов различного размера объясняетчастичную диссоциацию: большая по размеру фракция оказывается устойчива кдиссоциации, а меньшая диссоциирует. Теоретически это позволяет варьироватьустойчивость комплекса изменением размера везикул, что может оказаться практическиважным в дальнейшем.79ΔΩ/ΔΩmax1.00.80.60.40.20.0020406080100120140Время, минутыРис. 31. Зависимость относительной электропроводности ФС1-/ФХ липосомы-везикулы суспензии отвремени. Общая концентрация липидов 1 мг/мл; [ФС1-]/[везикулы] = 2/3; 10-2 М трис буфер, рН 7.0;20 ºС.Для оценки биодеградируемости везикул и их комплексов были проведеныопыты, где была исследована ферментативная устойчивость полипептидных везикул иих комплексов с липосомами по отношению к трипсину, который катализируетгидролиз пептидных связей в катионной части везикул, представленной блокомполиаргинина.Для оценки устойчивости полиаргининовых везикул по отношению к ферментубыли приготовлены растворы везикул концентрации 5×10-4 осново-моль/л в буфереТРИС при рН = 8.0, поскольку оптимум каталитической активности трипсина находитсяв области рН = 7.8-8.0.

Во всех опытах добавляли столько фермента, чтобы егоконцентрация в растворе составляла 0.03 масс. %.Аналогично были приготовлены растворы комплексов везикул и анионныхлипосом ПОФС/ФХ для изучения их ферментативной устойчивости двух типов – с80избыткоманионного(отрицательно-заряженныекомплексы)икатионного(положительно-заряженные комплексы) компонентов. Далее к ним также добавлялифермент.После приготовления растворов везикул и их комплексов в присутствии ферментав течение недели следили за изменением электрофоретической подвижности и размерачастиц в растворах. Параллельно проводились измерения для контрольных растворовЭФП, (мкм/c)/(В/cм)везикул и комплексов, не содержащих фермента.3123456210-1-201234567Время, дниРис.

32. Зависимость ЭФП везикул R60L20 (1 и 4), частиц положительно заряженного комплексаанионные липосомы ПОФС/ФХ-полипептидные везикулы (2 и 5) и частиц отрицательно заряженногокомплекса ПОФС/ФХ-полипептидные везикулы (3 и 6) от времени в присутствии (1,2 и 3) и вотсутствии (4, 5 и 6) фермента (трипсина); ν = 0.1; Слип= 0,5 мг/мл (2, 5); Слип= 1,5 мг/мл (3, 6);[N+]внеш= 5×10-4 осново-моль/л; 10-2 М трис буфер; рН = 8.0;Т = 25 ºС.На Рис. 32 приведены зависимости ЭФП от времени, полученные для везикул иих комплексов с анионными липосомами. Кривые 1 и 4 демонстрируют изменение ЭФПсуспензий везикул в присутствии фермента и без него. Как видно из кривой 1 Рис. 32,значение ЭФП раствора везикул с ферментом с течением времени падает и выходит наплато.

Таким образом, на четвертый день везикулы разрушаются под действием81фермента, а дальнейший отрицательный заряд, по-видимому, формирует отрицательнозаряженный фермент в растворе. Параллельное измерение размеров показалоуменьшение размера частиц. Начальный средний размер везикул составлял 460 нм, вобласти, соответствующей «0» ЭФП наблюдается агрегация и образование частицразмера порядка нескольких микрон. После выхода кривой 1 (Рис. 32) на плато размерчастиц падает, достигая примерно 100 нм, что соответствует размеру молекулытрипсина.Для наглядности представлены результаты контрольного опыта для суспензиивезикул без добавления фермента (Рис.

32, кривая 4), в котором изменения значенияЭФП не наблюдается. Размер частиц также не меняется.Комплексообразование полипептидных везикул с анионными липосомами непрепятствует биодеградируемости везикул как в положительно так и в отрицательнозаряженных комплексах (Рис. 32, кривые 2 и 3 соответственно). Комплексыполиаргининовые везикулы-анионные липосомы под действием трипсина разрушаютсяза время наблюдения. Как видно из кривой 2 Рис.

32, значение ЭФП раствораположительно заряженных комплексов с ферментом резко падает и достигает «0» ужечерез 15 минут после добавления фермента. Далее значение ЭФП падает и через 3-4 днядостигает минимального значения ЭФП. Затем значение ЭФП немного повышается идостигает значения для трипсина, что может говорить о полном разрушенииполипептидных везикул под действием фермента. Параллельное измерение ЭФПраствора положительно заряженного комплекса без фермента также представлено наРис. 32, кривая 5. Значение ЭФП слабо уменьшается с течением времени, что можетбыть связано с процессами окисления и разрушения липосом.Аналогичные результаты, получены для отрицательно заряженных комплексов.Кривая 3 на Рис.

32 демонстрирует падение ЭФП в течение времени, что говорит оразрушении комплексов в избытке липосом. Агрегаты при этом не образуются, так какизбыточный отрицательный заряд препятствует этому. Контрольные опыты вотсутствие ферментов представлены на Рис. 32, кривая 6. Из графиков видно, что вотсутствие фермента падение ЭФП происходит, но значительно слабее, чем придобавлении фермента.В дополнение были проведены аналогичные эксперименты с использованиемдругого фермента – α-химотрипсина. Этот фермент преимущественно разлагает82пептидную связь при гидрофобных аминокислотах, содержащих ароматическое кольцо(тирозин, триптофан и фенилаланин).

Однако, с меньшими скоростями гидролизуеттакже лейцин и метионин. Оптимум каталитической активности α-химотрипсина лежитЭФП, (мкм/c)/(В/cм)в области рН = 7.5-8.2.3212345610-1-20123Время, дниРис. 33. Зависимость ЭФП везикул R60L20 (1 и 2), частиц положительно заряженного комплексаанионные липосомы ПОФС/ФХ-полипептидные везикулы (3 и 4) и частиц отрицательно заряженногокомплекса ПОФС/ФХ-полипептидные везикулы (5 и 6) от времени в отсутствии (1,3 и 5) и вприсутствии (2, 4 и 6) фермента (α-химотрипсина); ν = 0.1; Слип= 0,5 мг/мл (3, 4); Слип= 1,5 мг/мл (5, 6);[N+]внеш= 5×10-4 осново-моль/л; 10-2 М трис буфер; рН = 8.0; Т = 25 ºС.На Рис. 33 приведены зависимости ЭФП от времени, полученные для везикул иих комплексов с анионными липосомами.