Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 11
Описание файла
PDF-файл из архива "Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 11 страницы из PDF
Данные Рис. 14, перестроенные в соответствии с уравнением 6,описывались линейной зависимостью во всем интервале 1/ν (Рис. 20). Таким образом,СК+ индуцировали флип-флоп во всех адсорбированных липосомах.При низком содержании ФС1- индуцированный СК+ флип-флоп не оказываетвлияния на целостность липосом, поскольку миграция ФС1- с внутренней сторонымембраны на внешнюю компенсируется переходом равного количества нейтральныхФХ молекул в противоположном направлении: с внешней стороны мембраны навнутреннюю.
Предельное содержание ФС1-, при котором адсорбированные липосомысохраняют свою целостность, составляет 0.5. При повышении доли анионного липида до0.54 его переход на внешнюю сторону мембраны уже не может быть компенсировансинхронным перемещением нейтрального липида: в бислое появляются дефекты, чторегистрируется кондуктометрически (Рис. 17). Геометрическая комплементарностьанионного и нейтрального липидов оказывает существенное влияние на стабильностьадсорбированных липосом.
Липосомы, в которых КЛ2- , имеющий форму усеченногоконуса, распределен среди цилиндрического ФХ, разрушаются при 0.3 содержании КЛ2-.Мембрана, содержащая смесь цилиндрического ФС1- и цилиндрического ФХ, сохраняетцелостность вплоть до 0.5 содержания ФС1-.Cлипосом (ЭФП=0), мг/мл610.80.70.60.50.40.30.20.12468101/νРис. 20. Зависимость концентрации липосом в комплексе с ЭФП=0 от 1/ν. [СК+] = 1×10 М, 10-2 М-4трис буфер, рН 7; 20 ºС.Как анионные ФС1- молекулы распределены в мембране ФС1-/ФХ липосом послеих адсорбции на поверхности поликатионных щеток? Для ответа на этот вопрос мыиспользовали второй из упомянутых выше методов: дифференциальную сканирующуюкалориметрию (ДСК).
С его помощью можно анализировать фазовые переходы влипидном бислое, что в свою очередь позволяет следить за микрофазовым разделениемвмембранеадсорбированныхлипосом.Липидныйбислойхарактеризуетсятемпературой фазового перехода (температурой плавления) Тф. Ниже температуры Тфлипидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностьюлипидных молекул (“твердые” липосомы). При температуре выше Тф мембранапереходит в жидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней62значительно возрастает (“жидкие” липосомы). В наших экспериментах природный ФХ,представляющий собой смесь липидов с различными температурами плавления, былзамененнасинтетическийаналог,дипальмитоилфосфатидилхолин(ДПФХ),стемпературой плавления 41 ºС.
Калориметрическая кривая, отражающая плавлениелипосом, сформированных из нейтрального ДПФХ, представлена на Рис. 21а (кривая 1)и воспроизведена на Рис. 21б (кривая 1) и Рис. 21в (кривая 1).Калориметрическая кривая смешанных ФС1-/ДПФХ липосом с = 0.1 (Рис. 21а,кривая 2) характеризовалась широким фазовым переходом с пиком при 39 °С и плечомпри 35 оС, которые отвечали плавлению двух смешанных ФС1-/ДПФХ микрофаз сразличным соотношением компонентов. В дополнение к этому на кривой был еще одинпик при 41 °С, который указывал на присутствие в мембране доменов, состоявшихтолько из молекул электронейтрального ДПФХ.Комплексы СК+/липосома для калориметрических исследований готовилиследующим образом. Суспензии липосом и СК+ предварительно прогревали вышетемпературы фазового перехода бислоя и смешивали, после чего полученную смесьохлаждали до комнатной температуры.
Добавление СК+ к суспензии липосом с = 0,1делало пик фазового перехода более узким с максимумом при 41 °С (Рис. 21а, кривая 3),который отражал образование ДПФХ доменов, освобожденных от анионного ФС -1 врезультате связывания последнего в электростатический комплекс с СК+. Плечо при40 ºС отвечало доменам ДПФХ с незначительной примесью ФС-1. Что касаетсякомплекса липосома/СК+, его фазовый переход лежал в области температур ниже 5ºС,за пределами возможностей использованного микрокалориметра.63Эндо12302030Температура,40oCаЭндо1230203040Температура, oCбЭндо1230203040Температура, oCвРис. 21. Калориметрические кривые ДПФХ липосом (1), ДПФХ/ФС1- липосом (2), и комплекса с СК+.
ν =0.1 (a), 0.3 (б) и 0.5 (в); 10-2 М трис буфер, рН 7.0.64Наконец, доля ФС-1 в липосомальной мембране была увеличена до = 0.5, чтосоответствовало предельному содержанию ФС-1, при котором липосомы все ещесохраняли свою целостность после адсорбции. Широкий фазовый переход в такихлипосомах (Рис. 21в, кривая 2) указывал на образование доменов с различнымсоотношением обоих липидов. Последующее добавление СК+ к суспензии липосом неприводило к появлению 41 ºС пика на калориметрический кривой и, следовательно, невызывало разделения мембраны на две микрофазы: чистого ДПФХ и ФС-1, связанного вкомплекс с катионными группами СК+.
В адсорбированных липосомах с = 0.5 (так же,как и в случае липосом с = 0.3) нейтральный ДПФХ формировал смешанные домены санионным липидом.Строение мембраны адсорбированных липосом представлено на Рис. 22. Приневысоком содержании ФС-1 бóльшая часть ФС-1 молекул сосредоточена в области,непосредственно примыкающей к поверхности СК+. Лишь немногие молекулы ФС-1остаютсянапротивоположной(внешней)сторонеадсорбированныхлипосом,обращенной в буферный раствор (Рис. 22а); именно эти немногочисленные молекулыФС-1 придают комплексу невысокий отрицательный заряд, регистрируемый методоммикроэлектрофореза (Рис.
14, кривая 1). Увеличение доли анионного липида до = 0.3 идалее до = 0.5 приводит к последовательному увеличению количества молекул ФС1- навнешней стороне адсорбированных липосом (Рис. 22б) и, как следствие, кпрогрессивному возрастанию отрицательного заряда комплекса (Рис. 14, кривые 2-5).балипосомаСК+ (фрагмент)липосомаСК+ (фрагмент)Рис. 22.
Схематическое представление липосом с низким (а) и высоким (б) содержанием анионноголипида до (левые части рисунков а и б) и после (правые части рисунков а и б) связывания с СК+. Низкоесодержание липида соответствует v = 0.1, высокое содержание липида v = 0.3.654.3. Комплексы, содержащие липосомы с различными наполнителями.Сказанное выше относится к комплексам, полученным путем адсорбции наповерхности щеток липосом, заполненных водорастворимой солью (NaCl). Однакоописанныйприемпозволяетформироватьмультилипосомальныеконтейнеры,содержащие липосомы с различными наполнителями.
В этом случае адсорбируемаясмесь может быть приготовлена из липосом одинакового липидного состава, носодержащих различные – гидрофильные (водорастворимые) и/или гидрофобные(мембранорастворимые) – инкапсулированные вещества. Такие вещества не будутвносить вклад в суммарный отрицательный заряд липосом и поэтому не будут влиять наспособность липосом связываться с положительно заряженными сферическимищетками. Можно ожидать, что соотношение липосом в адсорбированном слое не будетотличаться от их соотношения в липосомальной смеси до адсорбции.Для проверки этой гипотезы были приготовлены три типа ФС1-/ФХ ( = 0.1)липосом. Первые были заполнены водным раствором 7-гидроксифеноксазона (лакмуса)(Ллак); в мембрану вторых был встроен гидрофобный краситель 1,1-диоктадецил3,3,3’,3’-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорат (ДИЛ) (ЛДИЛ); третьи содержалидипальмитоил-фосфатидилэтаноламин, ковалентно меченый карбоксифлуоресцеином(ДПФЭ-КФ) (ЛКФ).
Вещества, различными способами включенные в состав липосом,подбирались таким образом, чтобы при дальнейшем исследовании смеси всех трехвидовлипосомиихкомплексовсполикатионнымищеткамиметодомспектрофотометрии пики были разрешимы. Как видно из Рис. 23, липосомы содержалиразные типы наполнителей: (1)гидрофильный, (2)гидрофобный и (3)гидрофильный сгидрофобным якорем.66Лакмус(гидроксифеноксазон –хромофорный компонент)а1,1-диоктадецил-3,3,3’,3’тетраметилиндокарбоцианин перхлоритбдипальмитоилфосфатидилэтаноламин,ковалентно меченыйкарбоксифлуоресцеином(ДПФЭ-КФ)вРис. 23. Схематическое изображение липосом с различными наполнителями: лакмусом (а), ДИЛ (б) иДПФЭ-КФ (в).67Суспензии трех типов липосом смешивали в разных весовых соотношенияхQисх=(Ллак)исх/(ЛДИЛ)исх/(ЛКФ)исх, и полученные смеси добавляли к суспензии СК+ с такимрасчетом, чтобы суммарная концентрация липосом вдвое превышала ту, котораяобеспечивала насыщение поверхности щеток.
После отделения комплексов путемцентрифугированиябылинеадсорбировавшиесяполученылипосомы.спектрыЛипосомы,супернатантов,заполненныесодержащихрастворомлакмуса,детектировали при 586 нм, липосомы со встроенным ДИЛ при 551 нм и липосомы сДПФЭ-КФ при 498 нм. Сравнение спектров суспензий липосом до добавления щеток ипослеотделениякомплексовпозволилоколичественнооценитьсоотношениесвязавшихся с поликатионными щетками липосом.На Рис. 24 представлены спектры для растворов индивидульных липосом, а такжеспектры для смеси трех растворов, где липосомы были взяты в различныхсоотношениях до и после адсорбции на СК+.1,0оптическая плотность123450,50,0400500600700800длина волны, нмРис.
24. Спектры поглощения липосом, меченных карбоксифлуоресцеином (1), меченных ДИЛ (2),меченных лакмусом (3), смесь трех типов липосом (в соотношении КФ:ДИЛ:Лакмус = 1:1:0.66) докомплексообразования с СК+ (4) и в супернатанте после отделения комплекса на центрифуге (5).68Полученные результаты пересчитывали в концентрации связавшихся со щеткамилипосомипредставляливвидевесовогосоотношенияQкомп=(Ллак)комп/(ЛДИЛ)комп/(ЛКФ)комп. Как видно из данных Таблицы 1, Qисх=Qкомп для всехисследованных смесей. Иными словами, соотношение липосом в адсорбционном слоевсегда совпадало с их соотношением в исходной смеси.
Описанная методика являетсяхорошейиллюстрациеймультилипосомальныхпредлагаемогоконтейнеровнамиспростогоспособаконтролируемымполучениясодержаниеминкапсулированных веществ.Таблица 1. Связывание СК+ со смесями липосом.Исходная смесьИсходная смесьКФ:ДИЛ:ЛакмусКФ:ДИЛ:Лакмус11:1:0.661:1.15:0.622:1:01.85:1:031:1.5:0.11:1.4:0.164.4. Комплексы поликатионных щеток с рН-чувствительными липосомами.Длятогочтобы"открыть"липосомальныеконтейнерыивысвободитьбиологически активное содержимое не случайным образом, а при попадании их вслабокислую среду характерную для воспаленных тканей и опухолей был использованследующий подход.