Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 10
Описание файла
PDF-файл из архива "Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 10 страницы из PDF
Форма молекулыФС1- напоминает цилиндр с почти равными площадями сечения «головки» и алкильных«хвостов».Взаимодействие таких липосом с поликатионными щётками ничем не отличаетсяот взаимодействия с СК+ липосом, содержащих кардиолипин в качестве анионногокомпонента. На Рис. 14 представлены зависимости изменения ЭФП от количествадобавленных к щёткам липосом. Из рисунка видно, что добавление суспензии липосом,содержащих ФС1-, к СК+ сопровождается уменьшением ЭФП частиц, которая достигаетнулевого значения при концентрации отрицательного заряда равного 1×10 -4 М (длялипосом с ν = 0.1 это соответствует 0.72 мг/мл), что эквимольно концентрацииположительных зарядов в системе. Дальнейшее добавление липосом приводит кперезарядке поверхности комплексов.
Увеличение доли анионного липида в липосомахприводит к уменьшению количества липосом требуемого для нейтрализации зарядащёток. Причём количество отрицательно заряженного липида в нейтральном комплексеостаётся эквимольным количеству положительно заряженных групп щёток.
Величинамаксимального отрицательного значения ЭФП зависит от доли фомфатидилсерина вмембране и растёт по мере увеличения отрицательного заряда липосом. Так длякомплексов с липосомами с долей анионного липида 0.1 максимальный отрицательныйзаряд составляет -0.5 (кривая 1), в то время как для липосом с содержаниемфосфатидилсерина 0.4, 0.5 и 0.54 (кривые 4, 5 и 6) ЭФП максимальное достигает -2,2.ЭФП, (мкм/c)/(В/cм)53412345620-20.00.51.0Cлипосом, мг/млРис. 14. Зависимость ЭФП частиц комплекса СК+/липосомы ФС1-/ФХ от концентрации липосом.Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (6). [СК+] =1×10-4 осново-моль/л; 10-2 М трис буфер рН 7.0; 20 °С.Параллельные измерения размеров частиц (Рис. 15) показали, что начальноедобавление липосом к поликатионным щёткам не приводит к увеличению размеровчастиц.
По мере приближения заряда частиц к 0 увеличиваются их размеры, чтообуславливается агрегацией нейтральных частиц. После достижения максимальныхразмеров, при перезарядке частиц наблюдается уменьшение их размеров. Придвукратном избытке отрицательного заряда размеры частиц достигают своегоначального значения.D, нм541234563000200010000.00.51.0Cлипосом, мг/млРис. 15. Зависимость гидродинамического диаметра частиц комплекса СК+/липосомы ФС1-/ФХ отконцентрации липосом.
Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5(5), 0.54 (6). [СК+] = 1×10-4 осново-моль/л; 10-2 трис буфер; pH 7.0; 20 °С.Для оценки количества адсорбировавшихся на одну щётку липосом был проведёнэксперимент с флуоресцентно меченными липосомами, аналогичный представленномувыше для кардиолипиновых липосом (раздел 4.1.1). На Рис. 16 приведена зависимостьколичества несвязавшихся липосом от количества липосом, добавленных в систему. Поточке излома определяли максимально возможное количество липосом связавшихся сщётками. Очевидно, что при концентрациях липосом ниже этой точки, все добавленныелипосомы связываются с щётками.Полученные результаты позволили рассчитать предельное количество липосом,адсорбированных на одной катионной щетке по уравнению 1.
Это количество не зависитот природы анионного липида и составляет около 40 липосом с ν = 0.1 и спадает до 16при ν = 0.4.Cлипосом в супернатанте, мг/мл55123450.020.010.000.00.20.40.60.81.0Cлипосом в системе, мг/млРис. 16. Зависимость концентрации ФС1-/ФХ липосом в надосадочной жидкости от общейконцентрации липосом в системе. ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5 (5); [СК+] = 1×10-4 основомоль/л; 10-2 М трис буфер, рН 7.0; 20 ºС.Влияет ли форма анионного липида на целостность (стабильность) липосом вкомплексе с графтированным поликатионом, ковалентно связанным с поверхностьюполистирольных латексных частиц? Для ответа на этот вопрос липосомы, заполненные1 М раствором NaCl, с различным содержанием «симметричного» ФС1- добавляли ксуспензии поликатионных щеток.
За целостностью липосом следили по вытеканию соливо внешний раствор и увеличению суммарной электропроводности суспензии. Каквидно из Рис. 17, соль не вытекала из липосом с ν ≤ 0.5 (кривые 1-5); последующееувеличениедолианионноголипидаприводилокбыстромувозрастаниюэлектропроводности (кривая 6), то есть к формированию дефектов в липосомальноймембране.ΔΩ/ΔΩmax561.00.80.61234560.40.20.004080120t, минРис.
17. Зависимость относительной электропроводности суспензии комплекса СК+/липосомыФС1-/ФХ от времени. Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4),0.5 (5), 0.54 (6) Общая концентрация липидов 1 мг/мл; [СК+]×10-4 осново-моль/л = 1.9 (1), 3.9 (2),5.9 (3), 7.9 (4), 9.9 (5), 10.1 (6); 10-3 М трис буфер, рН 7.0; 20 °С.Для контроля за обратимостью комплексообразования в системе «ФС1-/ФХлипосомы + СК+» использовали метод тушения/возгорания флуоресценции, описанныйвыше для системы с участием КЛ2--cодержащих липосом. Рис.
18 отражает тушениефлуоресценции ФИТЦ-меченых ФС1-/ФХ липосом с различным содержанием анионноголипида при их связывании с СК+. Добавление раствора соли к суспензиям комплексовСК+/липосома сопровождалось восстановлением флуоресценции до исходного уровняпри условии, что мольная доля ФС1- в липосомах не превышала 0.5 (Рис. 18, кривые1-5). Комплексы липосом с бóльшим содержанием ФС1- не диссоциировали придобавлении соли (кривая 6). Полученные результаты коррелировали с даннымикондуктометрии (Рис. 17): формирование дефектов в мембранах адсорбированныхлипосом делало их связывание со щетками необратимым.Флуоресценция, о.е.571.01234560.90.80.70.60.50.00.51.01.5[СК+]×10-4, осново-моль/лРис.
18. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе СК+/меченые липосомыФС1-/ФХ от концентрации СК+. Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3),0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (6). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; 10-2 М трис буфер, рН 7.0; 20 °С.Флуоресценция, о.е.581.00.91234560.80.70.60.20.40.60.8[NaCl], MРис. 19. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции комплекса СК+/меченые липосомыФС1-/ФХ от концентрации NaCl. Содержание анионного липида в липосомах ν = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3),0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (6). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; 10-2 М трис буфер, рН 7.0; 20 °С.Примечательно, что все полученные комплексы сохраняли устойчивость вфизиологическом растворе с [NaCl] = 0.15 М (Рис.
19). Адсорбционные экспериментыпозволили оценить предельное количество липосом, способных адсорбироваться наодной поликатионной щетке: от 40 для липосом с ν = 0.1 до 13 для липосом с ν = 0.5.Таким образом, замена «несимметричного» КЛ2- на «симметричный» ФС1- позволяет(1)сохранить адсорбционную емкость щеток по анионным липосомам и одновременно(2)расширитьинтервалсоставовлипосом,формирующихстабильныеэлектростатические комплексы с СК+.
Последнее может быть принципиально длясоздания мультилипосомальных контейнеров с контролируемой скоростью выходаразличных лекарств.594.2. Структурные перестройки в мембранах липосом, адсорбированных наповерхности поликатионных щётокИз литературы известно, что взаимодействие анионных липосом с линейнымикатионными полимерами может сопровождаться структурными перестройками влипосомальных мембранах: существенным ускорением трансмембранной миграциилипидных молекул (флип-флопом) и фазовым разделением в липосомальной мембране(латеральной сегрегацией липидов).
Для контроля за структурными перестройками вмембранах анионных липосом, связанных в комплекс с поликатионными щетками,следили, используя методы лазерного микроэлектрофореза и дифференциальнойсканирующей калориметрии.Первый из этих методов отражает изменение электрофоретической подвижностикатионных СК+ по мере заполнения их поверхности анионными липосомами, то естьпри нейтрализации поверхностного заряда щеток адсорбированными липосомами.
НаРис. 14 представлены зависимости ЭФП комплексов для липосом с различной мольнойдолей анионных ФС1- «головок». Видно, что во всех случаях образование комплексасопровождалось уменьшением поверхностного заряда СК+, и переходом его вотрицательную область при больших концентрациях липосом.
Увеличение долианионного липида в липосомальной мембране требовало меньшего количества(концентрации) липосом для нейтрализации заряда СК+ и одновременно повышаломаксимальный отрицательный заряд, приобретаемый СК+ в избытке липосом (ЭФПмакс).Кривая 1 на Рис. 14 описывает электрофоретическое титрование СК+ суспензиираствором ФС1-/ФХ липосом с = 0.1. Выше мы показали, что липосомы такого составаколичественно связываются с поликатионными щетками. Это означает, что в точкеЭФП=0 положительный заряд щеток численно равен суммарному отрицательномузаряду ФС1- липидов, расположенных на внешних (обращенных к СК+ поверхности)монослоях адсорбированных липосом, или в других терминах:[СК+] = [ФС1-]внеш, ЭФП=0(4)Доля ФС1- молекул, формирующих электростатические связи с СК+, быларассчитана следующим образом:γ = [ФС1-]внеш, ЭФП=0/[ФС1-]0, ЭФП=0 = [СК+]/[ФС1-]0, ЭФП=0(5),где [ФС1-]0, ЭФП=0 – общая концентрация ФС1- при ЭФП = 0.
Расчет по уравнению 5дает γ = 0.94×10-4M/1.01×10-4M ≈ 1. Принимая во внимание сохранение целостности60липосом после комплексообразования, полученный результат однозначно указывает нато, что адсорбция сопровождается переходом анионных липидов с внутренней сторонылипосомальной мембраны на внешнюю. Для случая ФС1-/ФХ липосом с = 0.1 мыможем записать:[СК+] = [ФС1-]внеш, ЭФП=0 = [ФС1-]0, ЭФП=0 = [Лип]ЭФП=0 × [Лип]ЭФП=0 = [СК+]/или(6),где [Лип]ЭФП=0 – концентрация всех (ФС1- + ФХ) липидов в растворе при ЭФП=0. Еслииндуцированный СК+ флип-флоп ФС1- молекул развивается в липосомах с различнымсодержанием ФС1-, уравнение 6 должно выполняться для всех исследованных систем(комплексов).