Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 12

В мембрану анионных липосом на стадии их приготовления быловстроено липидоподобное амфифильное соединение – алкилированное производноетранс-3,4-дигидроксипиперидина (ДОП) (Рис. 25). Повышение кислотности среды ипротонирование атома азота сопровождается образованием внутримолекулярнойводородной связи и изменением конформации ДОП-фрагментов и пространственнойориентации алкильных цепей. В липосомах со встроенным ДОП-липидом такойконформационный переход приводит к нарушению упаковки гидрофобной части бислояи высвобождению содержимого липосом в окружающую среду.

Использованные внаших экспериментах рН-чувствительные липосомы содержали три компонента (вмольных долях): анионный ФС1- (0.1), цвиттер-ионный ФХ (0.6) и ДОП-липид (0.3).Поведение рН-чувствительных липосом сравнивали с поведением традиционныхлипосом ФС1-/ФХ ( = 0.1).69Рис. 25. Конформационный переход в ДОП-липиде.На Рис. 26а приведена зависимость ЭФП катионных щеток от концентрациидобавленных тройных рН-чувствительных липосом в буферном растворе с рН 7(кривая 1).

Эта кривая полностью совпадает с ЭФП зависимостью катионных щеток вприсутствии бинарных ФС1-/ФХ липосом с  = 0.1, не содержащих ДОП-липида; кривая2 для бинарных липосом воспроизведена с Рис. 14 (кривая 1). Такой профиль кривойэлектрофоретического титрования для рН-чувствительных липосом отражает ихадсорбцию на поверхности катионных щеток при рН 7 и указывает на то, что движущейсилой адсорбции является образование солевых связей между анионными группамиФС1- и катионными группами СК+. Третичные аминогруппы ДОП-липида при этомзначении рН находятся в непротонированной (незаряженной) форме и поэтому невносят вклад в электростатическую адсорбцию ФС1-/ФХ липосом.ЭФП, (мкм/c)/(В/cм)70123210-10.00.20.40.60.81.0ЭФП, (мкм/c)/(В/cм)Cлипосом, мг/мл43345210-10.00.20.40.60.81.0Cлипосом, мг/млРис.

26. Зависимость ЭФП частиц CК+ от концентрации липосом. ФС1-/ФХ/ДОП липосомы: рН 7 (1) и5 (3); ФС1-/ФХ липосомы: рН 7 (2) и 5 (4); ФС1-/ФХ/ДОП липосомы были адсорбированы на поверхностиСК+ при рН 7, после чего раствор был подкислен до рН 5 (5). [СК+] = 1×10-4 осново-моль/л.Иная картина наблюдается в растворе с рН 5: ЭФП щеток в присутствии рНчувствительных липосом описывается горизонтальной прямой 3 (Рис. 26), в то времякак соответствующая кривая для бинарных липосом по-прежнему имеет δ-образный вид71(Рис. 26, кривая 4) характерный для системы «бинарные липосомы – СК+» в растворе срН 7. Эти результаты говорят об отсутствии взаимодействия рН-чувствительныхлипосом со щетками при рН 5 и адсорбции бинарных анионных липосом наповерхности щеток в этих условиях.

Причина такого расхождения в поведении липосомс ДОП-липидом и без него заключается в следующем. Понижение рН растворасопровождаетсяпротонированиемаминогруппДОП-липида,нейтрализациейположительного заряда ФС1- молекул и уменьшением суммарного заряда рНчувствительных липосом. При рН 5 заряд липосом переходит в положительную областьи становится равным 0.78 (мкм/с)/(В/см). Такие липосомы перестают связываться сположительнозаряженнымищетками.Чтокасаетсябинарныхлипосом,ихотрицательный заряд в основном определяется фосфатными группами ФС1- молекул,степень диссоциации которых близка к максимальной при обоих значениях рН.

Именноэто и определяет одинаковую эффективность связывания бинарных липосом с СК+ прирН 7 и 5.После этого мы сформировали комплекс катионных щеток и рН-чувствительныхлипосом при рН 7 и затем закислили внешний раствор до рН 5. Этот экспериментмоделировал ситуацию, когда мультилипосомальный контейнер из кровотока с рНблизким к нейтральному попадает в слабокислую среду характерную для воспаленныхтканей и опухолей. Сохранится ли комплекс при закислении среды, или положительныйзаряд,создаваемыйпротонированнымиДОП-липидами,вызоветдиссоциациюкомплекса?Зависимость ЭФП комплекса, полученного в растворе с рН 7 и затем доведенногодо рН 5, представлена на Рис.

26 (кривая 5). Видимое на рисунке отсутствие измененийЭФП могло быть следствием двух причин. Комплекс мог сохраняться при закислениираствора, тогда регистрируемый нами положительный заряд отражал протонированиеДОП-липида в составе комплекса либо комплекс диссоциировал в растворе с рН 5, и мыфиксировали положительный заряд поверхности СК+, освобожденной от липосом.Чтобы сделать выбор между этими вариантами, были проведены дополнительныеэксперименты по измерению размера частиц в системе методом динамическогосветорассеяния (Рис.

27).D, нм7212001238004000.00.30.60.91.21.5Cлипосом, мг/млРис. 27. Зависимость гидродинамического диаметра частиц CК+ от концентрации липосом. ЛипосомыФС1-/ФХ/ДОП: рН 7 (1) и 5 (2); ФС1-/ФХ/ДОП липосомы были адсорбированы на поверхности СК+ прирН 7, после чего раствор был подкислен до рН 5 (3). [СК+] = 1×10-4 осново-моль/л.Добавление рН-чувствительных липосом к суспензии СК+ при рН 7 приводило кукрупнениючастицвсистеме(кривая1),агрегатынаибольшегоразмераобразовывались при полной нейтрализации заряда щеток зарядом адсорбированныхлипосом (ср. кривую 1 на Рис. 27 и кривую 1 на Рис.

26). Смешение тех же компонентовпри рН 5 не свазывалось на размере частиц (Рис. 27, кривая 2), что коррелировало сотсутствием комплексообразования в этих условиях по данным электрофореза (Рис. 26,кривая 4). В «закисленной» системе мы наблюдали формирование агрегатов (Рис. 27,кривая 3), что очевидно указывало на сохранение связывания липосом с поверхностьющеток после смены рН раствора с 7 на 5.

Выше мы говорили о том, что связываниеанионных липосом с  = 0.1 с поликатионными щетками сопровождается латеральнойсегрегацией липидов, в результате которой бóльшая часть анионных липидных молекулконцентрируется в области, непосредственно примыкающей к поверхности щеток (Рис.7322б), при этом цвиттер-ионные молекулы ФХ и непротонированные молекулы ДОПлипида вытесняются на противоположную (обращенную во внешний раствор) сторонулипосомы. Электростатическое взаимодействие анионного домена в липосомальноймембране и катионной поверхности щеток оказывается настолько прочным, чтосохраняется и после протонирования ДОП-липидов и появления положительного зарядана внешней поверхности комплекса.Методом флуоресцентной спектроскопии (описанным в разделе 4.1.1) былопоказано, что каждая катионная щетка способна в среднем связать около 40 рНчувствительных липосом.Способность ФС1-/ФХ/ДОП липосом высвобождать инкапсулированное веществопри закислении раствора была исследована методом кондуктометрии.

В экспериментебыли использованы липосомы, заполненные 1 М раствором NaCl. Нарушениецелостности мембраны сопровождалось вытеканием соли во внешний раствор иувеличением электропроводности суспензии. Полученный результат сравнивали сэлектропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента – разрушениялипосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за100%.В контрольном эксперименте, когда заполненные солевым раствором липосомыдобавляли к суспензии щеток в буфере с рН 7, уровень электропроводности не менялсяв течение 2 часов после смешения компонентов.

Иными словами, целостность липосомсохранялась после их связывания с СК+. Закисление внешнего раствора до рН 5приводило к быстрому возрастанию электропроводности суспензии: до 50% за первые15 секунд, с постепенным выходом на максимум (60%) через 40 минут после смешения.Для липосом в отсутствии щеток в растворе с рН 5 наблюдалось гораздо болеемедленное вытекание соли: 12.5% за первые 10 минут после смены внешнего раствора срН 7 до рН 5.

Полученные результаты показывают, что липосомы со встроенным ДОПлипидом высвобождают инкапсулированное вещество в ответ на изменение рН раствораи скорость выхода вещества из мультилипосомальных комплексов существеннопревышает скорость выхода вещества из индивидуальных (не связанных в комплекс)липосом.Дополнительные эксперименты по вытеканию солевого раствора из липосом,содержащих липид-переключатель, в комплексе с СК+ при разных рН, показали, что74скорость вытекания соли зависит от величины рН.

Так при понижении величины рНраствора скорость вытекания соли увеличивается.4.5. Определение цитотоксичности комплексов поликатионных щёток санионными липосомами.Для определения цитотоксичности анионных липосом и их комплексов с СК+ былиспользован метод прижизненного окрашивания клеток метилтетразолевым синим.Проникший внутрь клеток краситель под действием окислительно-восстановительныхферментов окислялся до формазана, который выпадал в виде кристаллов. В погибшихклетках такого превращения красителя не происходило. Чем активнее происходилипроцессы жизнедеятельности в клетке, тем большее количество красителя в нейнакапливалось. Долю выживших (т.е. продуцирующих формазан) клеток оценивали,измеряя оптическую плотность при длине волне 550 нм, соответствовавшей максимумупоглощения формазана.На Рис. 28 представлены зависимости доли выживших клеток аденокарциномымолочной железы человека, обладающих множественной лекарственной устойчивостью,от концентрации добавленного реагента, в качестве которого выступали ФС1-/ФХлипосомы(1),поликатионныещетки(2),комплексыанионныхлипосомсполикатионными щётками разного состава: с избытком катионного(3) и анионного(4)компонентов.75Доля выживших клеток, %12010080601402320401E-30.010.1110Ссубстрата, мг/млРис.

28. Зависимость доли выживших клеток в присутствии ФС /ФХ липосом (1), СК+ (2), комплексов1-СК+/липосомы в избытке СК+ [СК+]/[ФС1-]=7 (3), комплексов СК+-липосомы в избытке липосом[ФС1-]/[СК+]=4 (4).Как следует из представленных на Рис. 28 данных, концентрации реагентов, прикоторых они убивали половину клеток (ЕС50), составляют 4.1 мг/мл для липосом,0.046 мг/мл для СК+, 0.0966 мг/мл и 1.104 мг/мл для положительно и отрицательнозаряженного комплекса соответственно.