Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами - формирование, строение и свойства, страница 4

Следовательно, это приводит кснижению температуры плавления [26].17Рис. 4. Температура основного фазового перехода для липидов различного строения [5].Образованиеводородныхсвязейдополнительному структурированию–междуголовамилипидовфосфотидилэтаноламиновыеприводиткпроизводныепоказывают самую высокую температуру основного перехода в силу образованияводородных связей между головами липида.2.1.5.2.

Влияние природы ацильного радикалаСостороныацильныххвостовсущественноевлияниенаплавлениеуглеводородных цепей оказывает наличие и положение в них ненасыщенных связей. Взависимости от расположения двойной связи Tm может варьироваться в диапазоне от40°C до –20°C, что было продемонстрировано на sn-1-октадецил-ненасыщенной связи.Расположение двойной связи в атомах С2-С8 приводит к линейному уменьшениютемпературы плавления с 40 до -20°C. Как было отмечено выше переход из цис- втранс- конформер приводит к увеличению площади молекулы липида.

Если изменениепроисходит в области, близкой к полярным головам, то конформационный переходсопровождается снижением упорядоченности в верхних структурированных частяхацильных хвостов, что драматически отражается на температуре плавления всегобислоя. Однако при расположении двойной связи на концах ацильных цепей,18кооперативность повышается и при приближении к центру бислоя влияние кратнойсвязи пропадает (Рис. 5).И наконец, количество хвостов, связанных с полярной головой может приводить кувеличению плотности упаковки липидов, что продемонстрировано в работе [27] напримере фосфатидной кислоты.

Наличие только одного ацильного хвоста приводит кувеличению температуры плавления на 25°C относительно ФХ-липидов.Рис. 5. Температура основного фазового перехода как функция положения двойной связи в липидедиоктадеканоил-ФЭА [28]Для чистых липидов температурный интервал фазового перехода обычноневелик, что указывает на кооперативный характер процесса. Изменение внешнихусловий может также вызывать изменения геометрической организации бислоя(мезофазныепереходы)иобразованиенебислойныхструктур(восновном,гексагональной фазы) [29;30]. В биологических мембранах липидный бислой наиболееблизок по своим свойствам к ламеллярной жидкокристаллической фазе [1, гл.

2].2.1.6. Стабильность липосом2.1.6.1. Химическая стабильностьЛипосомальная мембрана в основном состоит из фосфолипидов, подверженныхгидролизу по сложноэфирной связи [31]. Следствием гидролиза фосфолипидов является19реорганизация липидов из ламеллярной системы в мицеллярную [32]. При этомобразуются лизофосфатидилхолин и жирные кислоты [33], что приводит к увеличениюпроницаемости мембраны [34].

Другой путь деградации фосфолипидов – пероксидацияненасыщенных ацильных цепей [34]. Пероксидация липидов также приводит кувеличению проницаемости бислоя.2.1.6.2. Физическая стабильностьДисперсия липосом термодинамически не стабильна [35]. Общая свободнаяэнергия системы может быть снижена уменьшением площади поверхности. Липосомыобладают тенденцией к агрегированию под действием ван-дер-Ваальсовых сил.Присутствием других взаимодействий между частицами определяется стабильностьсистемы.Применениелипосомвкачественаноразмерныхконтейнеровдлялекарственных веществ [36;37], вакцин [38], ферментов или генетического материала[39] предполагает стабильность системы.В 40-х годах прошлого века Дерягин, Ландау [40] и Вервей, Овербек [41]независимо друг от друга разработали теорию коллоидной стабильности, или теориюДЛВО.

Она стала основной теорией, количественно описывающей стабильностьбольшинства коллоидных систем. Согласно этой теории стабильность системыобуславливается воздействием на коллоидные частицы в полярных растворах двухнезависимыхсил:ван-дер-Ваальсовусилупритяженияиотталкивающуюэлектростатическую силу.Теория ДЛВО применима для описания стабильности коллоидных систем,состоящих из поверхностно активных веществ (ПАВ) [42;43;44], амфифильных лекарств[45;46], латексов [47;48], белковых комплексов [49;50], а также липосом [51;52;53].

Несмотря на общий успех использования теории ДЛВО в приложении к стабильностилипосом присущи некоторые ограничения [54].Водная суспензия липосом является коллоидной системой, следовательновзаимодействие между везикулами может приводить к образованию либо стабильныхагрегатов, либо временных ассоциатов за счет протекания процессов, называемыхсоответственно коагуляцией и флоккуляцией. В результате протекания этих процессовсуспензия малых моноламеллярных везикул представляет собой смесь несколькихсосуществующих структур: малых индивидуальных везикул, флоккулированныхвезикул, агрегированных везикул и слившихся везикул.

Поскольку малые липосомы20термодинамически неустойчивы, «чистая» популяция малых моноламеллярных везикулсуществует только в разбавленных свежеприготовленных суспензиях. Расстояние междуфлоккулированнымивезикуламисоставляет50-100Å,расстояниежемеждуповерхностями двух липосом в агрегатах составляет около 5 Å. При столь маломрасстоянии (в агрегатах) возникает сильное межвезикулярное взаимодействие. Когдасоприкасающиеся участки сильно искривлены, это взаимодействие может приводить кобразованию энергетически более выгодных структур с большим радиусом кривизны,т.е.

к слиянию везикул. Известно, что к веществам, вызывающим агрегацию и (или)слияние липосом, относятся белки [55], полисахариды, катионы двух- и трехвалентныхметаллов[56],синтетическиеводорастворимыеполимеры,такиекакполиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, различные поверхностноактивные вещества(ПАВ) и др., с успехом использованные также для агрегации и слияния животных ирастительных клеток [57;58;59;60].При температуре выше фазового перехода слияние везикул протекает оченьмедленно,чтообусловленомежвезикулярнымисиламиотталкиванияиструктурированностью воды в межвезикулярном пространстве. При температурах нижеTmтежелипосомыбыстроувеличиваютсявразмерах.Процессслиянияодноламеллярных везикул, мембрана которых находится в состоянии геля, протекаеткак бы в две стадии.

Первая стадия приводит к образованию везикул со среднимдиаметром 950 Å. Предполагается, что процесс агрегации продолжается до образованияагрегатов, состоящих из 18 индивидуальных везикул, что связано со стремлениемсистемы к образованию наиболее плотной упаковки сферических частиц. Расстояниемежду мембранами двух агрегированных везикул составляет величину, меньшую 5.2 Å.После достижения этого критического размера происходит слияние с образованиемвезикул, имеющих диаметр 700 Å2.1.7. Подвижность липидных молекулПоложение липидных молекул в бислое друг относительно друга можетизменяться в результате двух процессов: латеральной диффузии и трансбислойноймиграции (флип-флопа).

Эти процессы сильно различаются по скорости.212.1.7.1. Латеральная диффузияЛатеральная диффузия – это тепловое движение липидных молекул в пределахмонослоя. Этот процесс изучают, как правило, с помощью внешних зондов –фотореактивных [61;62], спин-меченых [63], или флюоресцентных [64]. Для молекуллипидов в жидкокристаллической модельной мембране эффективная константаскорости латеральной диффузии находится в пределах 106-108 с-1 [1]. Таким образом,липидная молекула пробегает сферическую мембрану диаметром 10 мкм за 5 мин.Подвижность липидных молекул в плоскости бислоя зависит от плотности упаковкиуглеводородныхцепей:относительнобыстраядиффузиялипидоввжидкокристаллическом состоянии замедляется на несколько порядков при переходебислоя в состояние геля. Кроме того, латеральная подвижность липидов зависит отдлины и насыщенности углеводородных цепей [65], и содержания в мембранаххолестерина.

Скорость латеральной диффузии фосфолипидов с разными полярнымиголовками различается незначительно.2.1.7.2. Трансмембранная миграция (флип-флоп)Трансбислойная миграция (флип-флоп) липидов заключается в перемещениимолекул липидов из одного монослоя в другой. Это явление было открыто в 1971 годуКорнбергом и Макконеллом, которым удалось определить скорость флип-флопа вмалых моноламеллярных липосомах методом ЭПР [66].

Константы скорости флипфлопа липидов находятся обычно в пределах 10-3-10-6 с-1. В везикулах смешанногосостава скорость зависит от равновесного распределения фосфолипидов междунаружной и внутренней поверхностью мембраны. Природа самой липидной молекулытакже является фактором, определяющим скорость её трансмембранной миграции. Вработе [67] было показано, что скорость трансбислойной миграции фосфолипидазависит от длины углеводородных радикалов ацильных цепей и природы полярнойголовки, и в основном определяется энергией активации (около 40 ккал/моль) переносаего полярной головки через гидрофобную область бислоя.

Это достаточно большаявеличина, которая показывает, что при увеличении температуры на 10 °С скоростьфлип-флопа увеличивается почти в 19 раз. Скорость трансбислойной миграциилипидных молекул зависит также от фазового состояния бислоя и увеличивается припереходе из гель-фазы в жидкокристаллическое состояние [68].22На основании большого числа экспериментальных данных было выявлено, чтотранспорт низкомолекулярных заряженных или цвиттер-ионных гидрофильных молекулчерез липидный бислой обусловлен образованием флуктуационных водных каналов впорах, пронизывающих липидный бислой [69;70]. Также был сделан вывод, что переносионов и гидрофильных молекул через бислой осуществляется параллельно с флипфлопом по механизму образования торроидных пор, которые также фигурируют влитературе как «водные провода» или «водные каналы».Для ускорения транспорта внутреннего содержания липосом необходимо наличиев мембране дефектов, которые возникают на границе раздела доменов при наличиилипидов с геометрией обратного конуса, высокой разницы осмотического давлении, рНили ионной силы по разные стороны мембраны [71;72;73].

Для снижения скоростивытекания используют липосомы, состоящие из липидов с хорошей взаимнойрастворимостью. Также добавляют холестерин, снижающий скорость флип-флопалипидовивероятностьобразованиятороидныхпор.Можноиспользоватьуравновешивание осмотического давления, ионной силы и рН по разные сторонымембраны.Применение выше перечисленных способов снижения проницаемости мембранпозволило авторам работы [74] создать липосомы, способные удерживать модельныелекарства до 3 месяцев в биологическом окружении.2.2.

Применение липосомЛипосомы представляют собой широко используемую экспериментальнуюмодель, которая позволяет воспроизводить в искусственных условиях многие свойства ихарактеристики биологических мембран. Липосомы, как и биологические мембраны,представляют собой замкнутые системы, что делает их пригодными для изученияпассивного транспорта ионов и малых молекул через липидный бислой. Состав липидовв липосомах можно произвольно варьировать и таким образом направленно изменятьсвойства мембраны. В настоящее время хорошо разработаны методы включенияфункциональноактивных мембранных белков в липосомы. Такие искуственные белковолипидные структуры называются протеолипосомами [75]. Благодаря возможностиреконструкции мембраны из её основных компонентов удается моделироватьферментативные, транспортные и рецепторные функции клеточных мембран.