Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы, страница 6

2.Рис. 2. Схема действия биосенсора первого поколения.В основе первого предложенного биосенсора лежало каталитическоедействие фермента глюкозооксидаза (ГОД), под действием которой происходилоокисление глюкозы и фиксировалась концентрация расходующегося кислорода сиспользованием кислородного датчика [25].Наряду с определением кислорода при функционировании биосенсоровчасто используется метод детекции пероксида водорода, образующегося в ходеферментативной реакции, который основан на окислении или восстановлении Н2О230[97]. В биосенсорах для определения лактата в качестве электрокатализаторовиспользуют берлинскую лазурь [50, 51, 63] и фталоцианин кобальта [46, 64] (табл.1, §1.2).

Ранее было показано, что наиболее эффективное определение пероксидаводорода–поеговосстановлению,чтообеспечиваетнаивысшуючувствительности и низкий предел обнаружения аналита [99].Ко второму поколению относят биосенсоры, в которых для сопряженияэлектродной и ферментативной реакций используют диффузионно-подвижныепереносчики электронов, или медиаторы. Медиатор – низкомолекулярныйпереносящий электроны аналог редокс-кофактора фермента. Он представляетсобой редокс-пару, которая переносит электроны от редокс-центра фермента кповерхности электрода. В каталитическом цикле медиатор сначала реагирует свосстановленным ферментом и затем диффундирует к поверхности электрода, гдеподвергается быстрой электрохимической реакции с переносом заряда (рис.

3). Вбиосенсорах дляопределения лактата используют в качестве медиатораметиленовый зеленый [65], мелдоловый голубой [57, 66], гидроксиметил ферроцен[67, 68], комплексы окислительно-восстановительных полимеров осмия [69] идругие (табл. 1, § 1.2).Рис. 3. Схема действия биосенсора второго поколения.Наибольший интерес вызывают биосенсоры третьего поколения, в которыхактивный центр фермента может обмениваться электронами напрямую сматериалом электрода без использования каких-либо медиаторов (рис. 4) [98].31Рис. 4. Схема действия биосенсора третьего поколения.Однако известно ограниченное число ферментов, способных к прямомубиоэлектрокатализу в силу изоляции активного центра белковой оболочкой. Изпримерно 1555 известных оксидоредуктаз [100] только несколько способны кпрямому переносу электрона [101], среди которых лактатоксидаза не отмечена.Большинство этих ферментов содержат в активном центре гем, железо-серныекластеры или медь.

Биосенсоры третьего поколения обладают рядом преимуществ,средикоторыхпростотаустройстваименьшаячувствительностькинтерферирующим соединениям.Таким образом, среди электрохимических биосенсоров для анализа реальныхобъектов наибольшее распространение получили биосенсоры первого поколения сдетекцией пероксида водорода путем его окисления или восстановления. Присоздании высокоэффективных биосенсоров решающими факторами являютсявыбор трансдьюсера пероксида водорода и иммобилизация фермента наповерхности электрода.32Глава 3.

Электрокатализаторы окисления и восстановленияпероксида водорода3.1.Физико-химические характеристики электрокатализаторовокисления и восстановления пероксида водородаДля создания биосенсоров первого поколения одной из основных задачявляется нахождение наиболее эффективного трансдьюсера пероксида водорода.Определение пероксида водорода на платиновых электродах требуетиспользования высоких потенциалов (0.60 – 0.70 В) и представляет собойнеобратимый двухэлектронный процесс окисления Н2О2 [97]. При этом константаскорости окисления Н2О2 составляет порядка 10-6 см/с, а диапазон определяемыхконцентраций пероксида водорода – от 1·10-7 до 1·10-4 М [102].

Высокое значениерабочего потенциала влечет усиление мешающего влияния других восстановителейна отклик ферментного электрода, таким образом, важнейшим требованиемявляется использование низкопотенциального определения при использованиибиосенсоров для анализа биологических жидкостей. Именно поэтому гораздобольшей популярностью при создании ферментных электродов пользуется методопределения пероксида водорода, основанный на его восстановлении.Возможность избирательного определения пероксида водорода по реакцииего восстановления в присутствии кислорода на электродах, модифицированныхгексацианоферратом железа (берлинской лазурью) при нулевом потенциале и рН,близких к нейтральным, в широком диапазоне концентраций Н2О2, впервые былапродемонстрирована в 1994 году в лаборатории Электрохимических методовХимического факультета МГУ [27].

Регистрация пероксида водорода по еговосстановлениюпозволяетпонизитьпотенциалидостичьмаксимальнойселективности сенсора.В результате оптимизации процедуры осаждения пленок БЛ на электродахбыл создан селективный в широком диапазоне потенциалов электрокатализаторвосстановления H2O2 [103]. Как видно на рис.

5, при нулевом потенциале токвосстановления пероксида водорода в сотни раз превосходит таковой длякислорода. Использование низкого потенциала определения позволяет устранитьшумовой ток легко восстанавливающихся веществ.33Рис. 5. Вольтамперограмма электрода, модифицированного берлинской лазурью; – фоновый ток восстановления кислорода воздуха,  – ток восстановления 0.1 мМН2О2,  – 10 мкМ Н2О2 [103].ТаблицаСравнение2.электрокаталитическихсвойствианалитическиххарактеристик существующих систем для определения Н2О2Электроднаосновепероксидазы[106]Электрокаталитические свойстваЭлектрод,модифицированныйберлинской лазурью[107]0.130-40400-6004∙10-61·10-31∙10-2Платиновыймикроэлектрод[105]СенсорСелективность,j(H2O2)/j(O2)Электрохимическаяконстанта, см/сАналитические характеристикиКоэффициентчувствительности,2.81.51.0 ± 0.32.0·10-5-4.0·10-21.0·10-8-1.0∙10-61.0∙10-7-1.0∙10-2А∙М-1∙см-2Линейныйдиапазонопределяемыхконцентраций H2O2, МВтабл.2приведеносравнениеосновныхсуществующихэлектрокаталитических систем для определения пероксида водорода [104].

Видно,34что электроды на основе БЛ превосходят платиновые электроды на три порядка какпо электрохимической константе, так и по селективности определения пероксидаводорода в присутствии кислорода. В то же время стоимость катализатора,синтезируемого из неорганических солей железа, на три порядка ниже, чемплатинового. Диапазон определяемых концентраций пероксида водорода прииспользовании сенсора, модифицированного БЛ, достигает 5 порядков, чтозначительно больше, чем при использовании платинового или пероксидазногоэлектрода. Кроме того, электроды, модифицированные БЛ, в отличие отэлектродов на основе платины не подвержены отравлению низкомолекулярнымисоединениями (такими как тиолы, сульфиды и др.), а возможность использованиянизких потенциалов при определении Н2О2 позволяет избежать мешающеговлияния восстановителей, присутствующих во многих биологических системах(урат, аскорбат, парацетамол).

Все это позволяет значительно расширить областьприменения БЛ в качестве трансдьюсера пероксида водорода в биосенсорах дляанализа реальных объектов.Такимобразом,наиболееэффективнымэлектрокатализаторомдляопределения пероксида водорода при создании биосенсоров в настоящий моментявляется берлинская лазурь. Основными преимуществами сенсоров на основе БЛпо сравнению с аналогами является их стабильность, широкий диапазонопределяемых концентраций и высокая селективность в присутствии кислорода, атакже ряда восстановителей, присутствующих в биологических жидкостях.3.2.Берлинская лазурьБерлинская лазурь или феррицианид (II) железа (III) Fe4III[FeII(CN)6]3 – одноиз первых изученных координационных соединений, упоминания о которомотносятся к началу 18 века.

Однако исследования, опубликованные Неффом в 1978году [110-111], положили начало новому направлению – использованию БЛ вобласти электрохимии. Берлинская лазурь может образовывать электроактивныепленки после электрохимического осаждения на поверхности электродов. Впоследние 20 лет активно ведутся фундаментальные исследования пленок БЛ и ееаналогов с точки зрения их синтеза и структуры.35Химический синтез БЛ может быть проведен путем смешивания ионовжелеза и гексацианоферрата с различной степенью окисления атомов железа, тоесть, возможны оба варианта: Fe3+ + [FeII(CN)6]4- или Fe2+ + [FeIII(CN)6]3-.Осаждение БЛ на электродах проводится из водных растворов, содержащих смесьионов железа Fe3+ и феррацианида [FeIII(CN)6] 3-, либо самопроизвольно, либо припротекании катодного тока.

Первое электрохимическое осаждение БЛ былоосуществлено японскими учеными в 1982 году из водных растворов, содержащихионы Fe3+ и [FeIII(CN)6]3- в гальваностатическом режиме, при этом наблюдали заизменением потенциала рабочего электрода с течением времени [112]. Полученныекристаллы проанализированы методом циклической вольтамперометрии.Хронопотенциометрическиеисследованияэквимолярныхрастворовферрицианида и трехвалентного железа демонстрируют наличие двух плато: при0/70 В и при 0/40 В [113]. Эти плато соответствуют восстановлению открытогоранее комплекса FeIII[FeIII(CN)6] [114] и ионов трехвалентного железа. Циклическаявольтамперограмма (ЦВА) электрода, модифицированного БЛ, представлена нарис.

6.1 мА∙см-2-0.100.1 0.20.3 0.40.50.6 0.7 0.8 0.91.0Е, ВРис.6.Циклическаявольтамперограммаэлектрода,модифицированногоберлинской лазурью, в растворе 0.1 М HCl / 0.1 M KCl [107].На ЦВА пленок БЛ в растворах электролитов, представленной на рис. 6,можно выделить две пары пиков редокс-активности: положение первой парысоответствует формальному потенциалу 0.15 В и характеризует переходберлинской лазури в восстановленную бесцветную форму, именуемую берлинский36белый. Формальный потенциал второй пары пиков равен примерно 0.80 В исоответствует переходу берлинской лазури в окисленную форму, называемуюберлинский зеленый. В интервале потенциалов 0.20 – 0.80 В неорганическийполикристалл существует в виде яркоокрашенной берлинской лазури.Существует зависимость редокс-потенциала от активности ионов калия,подчиняющаяся уравнению Нернста: при уменьшении концентрации в раствореионов калия на порядок потенциал сдвигается в отрицательную областьприблизительно на 0.06 В.

Кроме ионов калия, в кристаллическую решетку БЛмогут проникать только ионы аммония, цезия и рубидия [115], другие одно- идвухвалентные катионы блокируют электроактивность БЛ.О качестве электродов, модифицированных пленками БЛ, можно судить поострой форме пиков окисления и восстановления, наблюдаемых на циклическихвольтамперограммах.ДлядостижениярегулярнойструктурыпленокБЛнеобходимо учитывать два основных фактора: потенциал электроосаждения изначение рН исходного раствора солей железа.

Значение рН исходного раствора,равное 1.0, является оптимальным для осаждения пленок [116, 117].Возможность избирательного определения пероксида водорода по реакцииего восстановления в присутствии кислорода на электродах, модифицированныхБЛ, впервые продемонстрирована в работе [108, 118]. Несколькими годами позже впечати появились работы по определению пероксида водорода, основанному наокислении пероксида водорода с помощью БЛ при высоком потенциале [102, 119,120].3.3.Использование берлинской лазури для создания биосенсоровпервого поколенияБерлинская лазурь находит широкое применение при конструированиибиосенсоров на основе иммобилизованных оксидаз. Первая работа в данномнаправленииопубликованав1994году[27].Примерамибиосенсоров,функционирующих на основе БЛ являются глюкозный биосенсор на основемодифицированногоберлинскойлазурьюстеклоуглеродногоэлектродасиммобилизованной в мембране нафион глюкозооксидазой [27, 108] и ферментныйэлектрод на основе модифицированной БЛ платины, при приготовлении которого37ГОД иммобилизовали в слой поли-2-фенилендиамина [109].