Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛОМОНОСОВАХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиПрибиль Медея МихайловнаВысокоэффективные лактатные биосенсоры наоснове инженерии иммобилизованнойлактатоксидазы02.00.02 – аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:д.х.н., профессор Карякин А.А.Москва – 20152СОДЕРЖАНИЕСПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................. 4ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................................................

5ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................................................... 12Глава 1. Лактат ...................................................................................................................................... 121.1.Актуальность определения лактата......................................................................................

121.2.Методы определения лактата ................................................................................................ 141.3.Неинвазивный мониторинг лактата ...................................................................................... 22Глава 2. Электрохимические биосенсоры .......................................................................................... 262.1.Принцип действия и классификация биосенсоров ................................................................. 262.2.Амперометрические биосенсоры для определения лактата ................................................ 28Глава 3.

Электрокатализаторы окисления и восстановления пероксида водорода ........................ 323.1. Физико-химические характеристики электрокатализаторов окисления ивосстановления пероксида водорода .................................................................................................. 323.2.Берлинская лазурь......................................................................................................................

343.3.Использование берлинской лазури для создания биосенсоров первого поколения .............. 36Глава 4. Иммобилизация ферментов при конструировании биосенсоров ...................................... 384.1.Методы иммобилизации ферментов ...................................................................................... 384.2.Иммобилизация лактатоксидазы ...........................................................................................

394.3.Мембраны на основе силоксанов ............................................................................................. 424.4.Мембраны на основе нафиона ................................................................................................. 45Глава 5. Сканирующая электрохимическая микроскопия ................................................................ 475.1.Общие сведения .........................................................................................................................

475.2.Принцип работы сканирующего электрохимического микроскопа ..................................... 485.3. Гибкие планарные микроэлектроды в качестве зондов для сканирующейэлектрохимической микроскопии ........................................................................................................ 48Глава 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................................................................... 536.1.Материалы ................................................................................................................................ 536.2.Оборудование............................................................................................................................. 546.3.Методы ......................................................................................................................................

60РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................................... 73Глава 7. Высокочувствительный биосенсор для определения лактата на основе лактатоксидазыи мембран с использованием силоксана ............................................................................................. 737.1.Получение электродов, модифицированных берлинской лазурью ........................................

737.2. Использование силоксана для иммобилизации фермента на поверхность планарныхэлектродов, модифицированных берлинской лазурью ...................................................................... 777.3. Использование сканирующей электрохимической микроскопии для скринингаферментсодержащих мембран различного состава ........................................................................

7937.3.1. Изготовление гибких планарных микроэлектродов и модификация их берлинскойлазурью807.3.2. Аналитические характеристики микросенсоров для определения пероксида водородав качестве зондов для сканирующей электрохимической микроскопии827.3.3. Получение изображения ферментсодержащей мембраны с использованиемсканирующего электрохимического микроскопа847.3.4.

Получениетрехмерногоизображенияферментсодержащихмембрансиспользованием сканирующего электрохимического микроскопа907.4. Лактатные биосенсоры на основе ферментсодержащих силоксановых мембранразличной плотности ........................................................................................................................... 957.5. Использование методов сканирующей электронной и лазерной микроскопии ипрофилометра для исследования ферментсодержащих мембран ................................................

1007.6. Аналитические характеристики высокочувствительного биосенсора для определениялактата ............................................................................................................................................... 105Глава 8. Биосенсор для определения высоких (миллимолярных) концентраций лактата ...........

1128.1.Методы сдвига диапазона определяемых концентраций в область высоких значений .. 1128.2. Использование перфторсульфонированного полимера для иммобилизациилактатоксидазы при создании биосенсоров для определения лактата ....................................... 1138.3. Скрининг различных составов ферментсодержащих мембран с использованиемсканирующей электрохимической микроскопии ..............................................................................

1158.4.Линейные сканирования двух ферментсодержащих мембран в растворах лактата ..... 1198.5. Сканирование четырех проб лактатоксидазы в смешанных мембранах методомсканирующей электрохимической микроскопии ..............................................................................

1208.6. Использование смешанных мембран для иммобилизации лактатоксидазы при созданиилактатных биосенсоров..................................................................................................................... 1238.7. Аналитические характеристики биосенсора для определения высоких содержанийлактата ............................................................................................................................................... 128Глава 9.

Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии ................................................. 1359.1. Модельная проточная тонкослойная ячейка со встроенным биосенсором дляопределения лактата ......................................................................................................................... 1359.2.Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии .................................................... 1399.3. Непрерывный мониторинг лактата в поте в состоянии покоя и в процессе физическойнагрузки................................................................................................................................................ 143ВЫВОДЫ ................................................................................................................................................................ 147СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................................................

1494СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙБЛберлинская лазурьЛОДлактатоксидазаГОДглюкозооксидазаЛДГлактатдегидрогеназасилоксанγ-аминопропилтриэтоксисиланПФСперфторсульфонированный полимер (аналог нафиона)НАДникотинамидадениндинуклеотидПАНОпорог анаэробного обменаКВВконденсат выдыхаемого воздухаПЭпланарный электродПЭТФполиэтилентерефталатПИАпроточно-инжекционный анализЦВАциклическая вольтамперометрия/вольтамперограммаСЭМсканирующая электронная микроскопияСЭХМсканирующая электрохимическая микроскопияСЛМсканирующая лазерная микроскопияфоновыйэлектролит0.1 М KCl, 0.1 M HClбуферныйраствор0.05 М KH2PO4, 0.1 M KCl, pH 6.0KМкажущаяся константа Михаэлиса5ВВЕДЕНИЕКонтроль за содержанием лактата в крови важен для клиническойдиагностики и спортивной медицины. В клинической диагностике уровень лактатав организме человека изменяется при наличии ряда заболеваний, например,гипоксиитканей,дыхательнойкардиогенногонедостаточности,илидиабета.бактериально-токсическогоВыработкалактатавшока,энергичноработающих скелетных мышцах может увеличиваться в десятикратном размере,что обосновывает интерес спортивной медицины к уровню лактата в крови.Разработка высокочувствительных, надѐжных и экспрессных методовопределения лактата представляет большой интерес.

Среди них биосенсорызанимаютоднуизлидирующихпозиций,таккакспецифичностьиммобилизованного фермента к своему субстрату позволяет проводить измерениянепосредственновобразце,несмотрянасложностьегосостава,безпредварительной пробоподготовки, что также сокращает время анализа. Внастоящее время для определения лактата широко используются биосенсоры,основанные на действии фермента лактатоксидазы, в таком случае осуществляетсядетектирование пероксида водорода, выделяющегося в ходе ферментативнойреакции. На сегодняшний день наиболее эффективными сенсорами на пероксидводорода являются электроды, модифицированные берлинской лазурью, котораяпозволяетизбирательноопределятьпероксидводородапореакцииеговосстановления в присутствии кислорода.Лактатоксидаза–оченьлабильныйфермент,поэтомуповышениестабильности является одной из ключевых задач при создании биосенсоров на еѐоснове.

Основные затраты рабочего времени приходятся именно на подбороптимальныхусловийиммобилизациифермента.Сканирующаяэлектрохимическая микроскопия является мощнейшим способом визуализации вближнейзонеповерхностнуюсканирующейипозволяетактивностьвотображатьлокальнуюмикроскопическомэлектрохимическойэлектрохимическуюразрешении.микроскопиидляАдаптацияскринингаферментсодержащих мембран позволяет существенно уменьшить трудоемкостьпоиска условий иммобилизации.6В клинической диагностике и спортивной медицине лактат определяют вкрови,однаковсѐбольшеевниманиеуделяетсянеинвазивнымметодамисследования, которые не нарушают целостности кожных и слизистых покровов, и,тем самым, исключают заражение и травматизм. Химический анализ образцов сцелью неинвазивной диагностики подразумевает наличие экскреторной жидкости,концентрации искомых метаболитов в которой коррелируют с содержанием их вкрови.