Диссертация (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов), страница 7

3.10, кривые 6).Зависимости интенсивности флуоресценции БР от pH (3,5 - 8,0) вбуферных растворах и растворах с БСА и с САЧ представлены на рис. 3.9и рис. 3.10, кривые 7 и 8.В буферных растворах БР наблюдаетсяmaxтолько при pH< 4,0, а затем с ростом pH практически неуменьшение I флизменяется. Такое поведение объясняется тем, что при pH > 4,0 молекулы БРнаходятся в форме дианионов и имеют значительный отрицательный заряд,что вызывает их экранировку дипольными молекулами воды. При3,5<pH<4,0 молекулы БР являются моноанионами, и имеют незначительныйотрицательный заряд, и поэтому экранировка дипольными молекулами водыпрактически отсутствует.47maxВ растворах БСА или САЧ I флБРизменяется от pH следующимmaxкрасителя растёт, но за счётобразом: при увеличении значения pH I флэффектатушенияфлуоресценциикрасителябелкамиономеньшеаналогичной величины для буферного раствора наномаркера (рис.

3.9 и рис.3.10, кривые 8). При pH < 5,0 интенсивность флуоресценции БР в растворахбелков низкая из-за эффективного связывания данного наномаркера с БСА ис САЧ. При больших значениях pH молекулы БР находятся в дианионнойформе, а молекулы сывороточных альбуминов отрицательно заряжены, чтоприводит к малоэффективному связыванию белков с молекулами красителя,что сопровождается незначительным тушением флуоресценции зонда вбелковых растворах (рис. 3.9 и рис. 3.10, кривые 8).Проведеманализизмененийфлуоресцентныххарактеристикнаномаркеров семейства флуоресцеина, происходящих в растворах c белком(САЧ или БСА), по сравнению с буферными растворами красителей.

Дляэтогоопределиминтенсивностивотношениемаксимумах(I )∆I =(I )(гдеспектрафлуоресценцииmaxфлбуфmaxфлбел((I )maxфлбуфmaxнаномаркеров в буферных растворах, I фл)максимумахисследуемыхспектровфлуоресценциибел− значенияисследуемых− значения интенсивности внаномаркеровврастворах с белком (бычьим или человеческим)) для различных значений pH.На рис. 3.11 и рис. 3.12 представлены зависимости ΔI от pH для БСА (рис.3.11) и САЧ (рис.

3.12) для Ф (кривая1), Э (кривая 2), Эр (кривая 3), БР(кривая 4).В буферных растворах зависимости интенсивности в максимумеспектра флуоресценции красителей от pH обусловлены формой, в которойнаходятся молекулы данного красителя (т.е.

зарядом молекул зонда:положительным,слабоотрицательным,сильноотрицательным).Взависимости от знака и величины заряда молекул наномаркера экранировка48Рис. 3.11. Зависимости ΔI от pH для растворов с БСА для Ф (1), Эр (2), Э (3)и БР (4).Рис. 3.12. Зависимости ΔI от pH для растворов с САЧ для Ф (1), Эр (2), Э (3)и БР (4).49дипольными молекулами воды флуоресцентных наномаркеров происходитпо-разному. При наличии сильно электроотрицательных атомов в маркерах(I – у Эр, Br – у Э, I и Cl – у БР) происходит сильное взаимодействиекрасителей с окружающей средой.Из рис. 3.11 и рис.

3.12 видно, что для всех исследованных красителей врастворах, содержащих альбумины (БСА или САЧ) значения интенсивностив максимумах спектров флуоресценции, значительно меньше аналогичныхзначений для буферных растворов этих красителей. При этом для разных pHmaxэто уменьшение различно. Для объяснения зависимости I флот pH вбуферных растворах красителей достаточно учитывать их заряд, но дляmaxобъяснения зависимости I фл( рН ) для их растворов, содержащих БСА илиСАЧ, нужно учитывать не только заряд маркеров, но и заряд самих белков.Из рис. 3.11 и рис. 3.12 видно, что оба рассматриваемых белка висследованном диапазоне pH являются тушителями (вызывают уменьшениеинтенсивности флоресценции). С увеличением значения pH тушениефлуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белковуменьшается (кривые 2-4 рис.

3.11 и рис. 3.12), что указывает на уменьшениесвязывание белков и наномаркеров. Из рис. 3.11 и рис. 3.12 видно, что видзависимости ∆I(pH) для Ф не совпадает с аналогичной зависимостью для егогалоген – производных для низких значений pH (рН < 5,0). Для этой областирН для Ф наблюдается рост ΔI (кривые 1 на рис. 3.11 и 3.12), в то время какдля Э, Эр и БР наблюдается уменьшение ΔI .

ПрирН > 5,0 ход этихзависимостей одинаков: наблюдается уменьшение ΔI с увеличением рН.Сравнениезависимостей∆IотpHдлярастворовкрасителей,содержащих БСА и САЧ, показало их подобие для одинаковых красителей(рис. 3.11 и 3.12), что объясняется тем фактом, что зависимость зарядовобоих альбуминов от pH имеет практически идентичный характер, с тойлишь разницей, что БСА положительно заряжен при pH < 4,9 и отрицательно50заряжен при pH > 4,9, а САЧ в целом положительно заряжен при pH < 4,7 иотрицательно заряжен при pH > 4,7.Как уже отмечалось выше для производных флуоресцеина (Э, Эр, БР)наблюдается линейная зависимость ∆I от pH для растворов как с БСА, так и сСАЧ.

Но эффективность уменьшения ∆I от pH для разных белков слегкаотличается. Для определения эффективности уменьшенияфлуоресценции(∆I)интенсивностиметодом наименьших квадратов был рассчитанкоэффициент наклона А прямых в зависимости ∆I = А∙[pH]+B. В табл. 3.1представлены значения А и погрешности его определения S A для галоген –производных флуоресцеина.Таблица 3.1. Значения коэффициента наклона A и погрешности S A дляисследованных красителей и белковКрасительБСАСАЧASAASAЭритрозин (Эр)-1,10,03-1,20,02Эозин (Э)-0,640,03-0,490,02-0,340,03-0,330,02БенгальскийРозовый (БР)Из табл. 3.1 видно, что для красителя БР коэффициенты А равны дляобоих исследованных белков.

Отличие А наблюдается для Э и Эр. Причемдля Э он больше для САЧ, в то время как для Эр он больше для БСА.Фактически коэффициент А представляет собой по модулю скоростьубывания величины ∆I от pH: видно, что эта скорость по модулю имеетнаибольшее значение для Эр, а по мере увеличения электроотрицательностиатомов наномаркера скорость по модулю уменьшается.51§ 3.3.

Концентрационное тушениефлуоресценции наномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминовВ данном параграфе представлены результаты исследований влиянияконцентрациисемействабелковнаинтенсивностьфлуоресценциифлуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) вбуферныхкрасителейрастворахвдиапазоне pH от 3,5 до 8,0. В качестве примера на рис. 3.13 представленыспектры флуоресценции БР для различных концентраций САЧ при pH 3,5. Изрис. 3.13 видно, что с ростом концентрации белков происходит тушениефлуоресценции.Как показали исследования, САЧ и БСА являются тушителямифлуоресценции зондов при рассматриваемых условиях, так как придобавлении их в раствор маркеров семейства флуоресцеина при различныхpH интенсивность флуоресценции Ф, Э, Эр и БР резко понижается посравнению с буферными растворами, не содержащими белков.Для установления эффективности такого были вычислены значения F0 − 1 для всех наномаркеров и белков различной концентрации [Q], гдеFF 0 , F- интенсивности флуоресценции наномаркера в буферных растворах ирастворахбелков (БСА или САЧ), соответственно.

Были построеныFзависимости  0 − 1 от [Q] (так называемые зависимости Штерна –FФолмера) для исследованных систем. В качестве примера, на рис. 3.14 - рис.3.17. представлены такие зависимости для САЧ. Из рис. 3.14 - 3.17 видно,чтографикиШтерна-Фольмераисследуемыхвданнойработефлуоресцентных красителей имеют нелинейный характер.FНелинейность зависимостей  0 − 1 отFнесколькихтиповмеханизмов[Q]обусловлена наличием(ковалентный, ионный) образования52Рис. 3.13. Спектры флуоресценции БР (3 мкМ) в растворах c различнымиконцентрациями САЧ: 0 (1); 10 (2); 20 (3); 50 (4); 100 (5); 150 мкМ (6) приpH 3,5.53FРис. 3.14. Зависимости  0 − 1 БР от концентрации САЧ при различныхFзначениях pH: 3,5(1); 4,0(2); 5,0(3); 6,0(4); 7,0(5) и 8,0(6).FРис. 3.15.

Зависимости  0 − 1 Эр от концентрации САЧ при различныхFзначениях pH: 3,5(1); 4,0(2); 5,0(3); 6,0(4); 7,0(5) и 8,0(6).54Рис.3.16.Зависимости F0 − 1FЭотконцентрацииСАЧприразличныхзначениях pH: 3,5(1); 4,0(2); 5,0(3); 6,0(4); 7,0(5) и 8,0(6).FРис. 3.17. Зависимости  0 − 1 Ф от концентрации САЧ при различныхFзначениях pH: 3,5(4); 4,0(3); 5,0(1); 6,0(2); 7,0(5) и 8,0(6).55комплекса флуоресцентный краситель – белок.

Константы связыванияфлуоресцентных красителей с белками ассоциируются с константамитушения флуоресценции наномаркеров,флуоресценциизондовсопределенныхдобавлениемизразличныхспектровконцентрацийсывороточных альбуминов (бычьего или человеческого).Вычислим константы тушения флуоресценции для всех исследованныхсистем. Для расчёта констант тушения сывороточными альбуминами (БСА,FСАЧ) флуоресценции красителей и для описания зависимостей  0 − 1 былаFFприменена сигмоидальная функция.

Так как зависимость  0 − 1 от [Q]Fимеет нелинейный характер, то процесс тушения флуоресценции длякаждого из четырех рассматриваемых маркеров с добавлением различныхконцентраций белков может быть описан следующим образом:F0= 1 + K ⋅ [Q] nF,(3.2)где n – коэффициент кооперативности (коэффициент Хилла).Нами были определены значения К, а затем и K сигм – константа тушенияфлуоресценции красителя, в данном случае являющееся константойсвязывания флуоресцентного зонда с сывороточным альбумином, K сигм =nK.На рис.

3.18 и 3.19 представлены зависимости K сигм флуоресценциинаномаркеров семейства флуоресцеина для растворов, содержащихБСА(рис. 3.18) и САЧ (Рис. 3.19). Из рис. 3.18 и рис. 3.19 видно, что для Ф(кривая 1) наблюдается немонотонная зависимость с максимумом при pH 5,0и pH 6,0, соответственно.