Диссертация (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов), страница 2

Установлено, что для всех исследованных красителей в растворах,содержащих альбумины, значения интенсивности в максимумахспектров флуоресценции, значительно меньше аналогичных значенийдля буферных растворов этих красителей. С увеличением значения pHтушение флуоресценции производных флуоресцеина (Э, Эр, БР) поддействием белков уменьшается. Вид зависимости ∆I(pH) для Ф несовпадает с аналогичной зависимостью для его галоген – производныхдля низких значений pH (рН < 5,0).2.

Установлена независимость степени анизотропии флуоресценциимолекул галоген – производных флуоресцеина от pH среды.3. Определены коэффициенты вращательной диффузии флуоресцеина,эозина, эритрозина и бенгальского розового и установлено ихуменьшение в растворах САЧ и БСА в широком диапазоне значенийpH.4. Показано, что при взаимодействии с сывороточными альбуминамиизменения спектрально – флуоресцентных характеристик галогенпроизводных флуоресцеина (Э, Эр, БР) имеют схожие закономерностии отличаются от характеристик самого флуоресцеина.5. Установлено уменьшение степени ассоциации красителей семействафлуоресцеинав растворах белков по сравнению с буфернымирастворами, сопровождающееся изменением структуры ассоциатов.6.

Обнаружено, что при увеличении значения электроотрицательностибоковыхатомоврадикаловвмолекулахкрасителейсемейства9флуоресцеинаихсвязываниессывороточнымиальбуминамиуменьшается в области от pI белков до физиологического pH = 7,4.7. Для наномаркеров семейства флуоресцеина установлено уменьшениевращательнойдиффузиииувеличениевременивращательнойрелаксации в растворах САЧ и БСА по сравнению с их буфернымирастворами.Научная и практическая значимостьПолученные в диссертационной работе данные по взаимодействиюнаномаркеров семейства флуоресцеина (флуоресцеина, эритрозина, эозина ибенгальского розового) с сывороточными альбуминами (человеческим ибычьим) при различных значениях pH имеют существенное значение дляпонимания и моделирования механизма связывания наномаркеров с белком идают информацию о влиянии окружающей биологический объект ифлуоресцентный краситель среды на процесс их соединения.Результаты об эффективности связывания флуоресцентного красителя ссывороточными альбуминами позволяют получить модель взаимодействиябелков с лекарственными препаратами и оценить факторы, влияющие нанего, и в соответствии с полученной информацией модифицировать данныйпроцесс.

Этот механизм может быть использован при создании илиусовершенствовании медицинских препаратов.Структура диссертационной работыДиссертационная работа состоит из введения, трёх глав, основныхрезультатов и выводов, и литературы. В первой главе описываются самиизучаемые объекты, а именно флуоресцентные маркеры - флуоресцеин и егогалоген – производные, сывороточные альбумины (человеческий и бычий);приведены элементы теорий по флуоресцентной спектроскопии и потушению флуоресценции; описаны спектры поглощения и молекулярнаяассоциация красителей; представлен обзор литературы, посвященнойисследованиямпоописаниюипоприменениюфлуорофоров,взаимодействующих с биологическими объектами: белками, клетками,10тканями и т.д.

Вторая глава посвящена методике определения степенимолекулярной ассоциации и угла между молекулами флуоресцентныхмаркеров,методикеполученияспектрально–люминесцентныххарактеристик растворов исследуемых в данной работе красителей, а так же вней приводится описание измерений спектров поглощения и флуоресценциинаномаркеров и объясняется приготовление растворов красителей сразличным значениям pH (от 3,5 до 8,0) с и без добавления белков, при этомварьируется как концентрация флуоресцентных зондов, так и сывороточныхальбуминов.

Третья глава включает в себя пять параграфов, в которыхописаны и проиллюстрированы полученные данные о спектральныххарактеристикахиконцентрационномтушениифлуоресценции,молекулярной ассоциации и о вращательной диффузииовсех четырехнаномаркеров в растворах без белка и содержащих сывороточныеальбумины.Взаключениеданнойработыпредставленыосновныерезультаты и выводы, приведен список работ, опубликованных по темедиссертации. Работа написана на 121 странице, включающих 62 рисунка, 1таблицу и 133 библиографических ссылок.11ГЛАВАI.СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕВЗАИМОДЕЙСТВИЯФЛУОРЕСЦЕТНЫХИССЛЕДОВАНИЯКРАСИТЕЛЕЙСБИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ (ПО ДАННЫМ ЛИТЕРАТУРЫ)§1.1.Физические основы флуоресцентной спектроскопииПод термином флуоресценция понимают разрешенный по спинуизлучательныйпереходмолекулыизвозбужденногосостояния(ссинглетного уровня S 1 ) в основное состояние (S 0 ):S 1 —› S 0 + հυ фл .(1.1)Характерные величины скоростей испускания такого перехода имеютпорядок 108 с-1, в соответствии со столь высоким значением скоростииспускания времена затухания ̴ 10-11 – 10-8 сек.

Временем жизни называютсредний период времени, в течение которого флуорофор пребывает ввозбужденном состоянии.Выделяют следующие основные характеристики, закономерности дляпроцесса флуоресценции: время затухания; для спектров поглощения илюминесценциисправедливоправилоЛевшина(правилозеркальнойсимметрии); квантовый и энергетический выходы; стоксов сдвиг [1 – 3].Явление стоксового сдвига, получившее своё название в честьнаблюдавшего его ученого Дж.

Стокса, заключается в том, что спектризлучения вместе с его максимумом перемещены сравнительно спектрапоглощения и его максимума в длинноволновую область, то естьпрослеживается убыль энергии. Формулировка закона Стокса, изложеннаявыше, дополнена внесёнными Ломмелем поправками и выражается в виденеравенства:hν max люм < hν max погл.(1.2)Для флуоресцентных веществ, находящихся в растворах, устойчиворегистрируется уменьшение энергии между возбуждением и испусканием.Основное объяснение возникновения такого эффекта заключается в быстройрелаксации на нижний колебательный уровень состояния S 1 .

В добавлении к12этому, как правило, осуществляется переход на возбужденные колебательныеуровни S 0 , являющийся причиной дополнительной убыли колебательнойэнергии. Эффект Стокса усиливается также благодаря взаимодействиюрастворителя с флуорофором, и реакции, происходящие в возбужденныхсостояниях, вносят свой вклад в это явление.Значительнуючастьинформацииопроцессахфлуоресценцииполучают благодаря времени затухания и выходу люминесценции, которыйбывает квантовым или энергетическим. Энергетический выход являетсяотношением испускаемой в виде люминесценции энергии к поглощеннойвозбуждающим светом энергии. Из-за стоксовых потерь его величинаменьше единицы. Квантовый выход (Q) представляет собой отношение числаиспущенных фотонов к числу поглощенных и может быть определенследующим образом:Q= Г/(Г+κ),гдеκ(1.3)–константаскоростибезызлучательнойдезактивациифлуоресцирующего вещества; Г – константа скорости излучательнойдезактивации флуорофора.В случае, когда κ << Г квантовый выход близок к единице.

Чем большезначение квантового выхода, тем эффективнее флуоресцентные свойствавещества. Для нефлуоресцирующих веществ величина квантового выходаили равна нулю или стремится к нему.Время жизни τ возбужденного состояния определяется уравнением:τ = 1/(Г + κ).(1.4)При отсутствии безызлучательных процессов (при κ = 0), время жизнифлуорофора называется собственным временем жизни (τ 0 ) и определяется поформуле:τ 0 = 1/Г.(1.5)Таким образом, можно найти соотношение между временем жизни иквантовым выходом:Q 1 = τ/τ 0 .(1.6)13§1.2. Элементы теории тушения флуоресценцииБольшое влияние на выход люминесценции оказывают внешниевоздействия, которые могут служить причиной тушения свечения.

Из-завнутри – и межмолекулярных взаимодействий происходит уменьшениезначения квантового выхода изучаемого вещества, именно этот процессназывается тушением флуоресценции, которое можно наблюдать, например,при добавлении посторонних примесей в раствор с люминесцирующимисоединениями. Тушителями называются вещества, вызывающие данныйэффект.Такжетемпературнымитушениеилифлуоресценцииможетконцентрационнымибыть(большоевызваноколичествофлуоресцирующего вещества) воздействиями.Какправило,безызлучательныхмеханизмпроцессовтушенияпотерисвязываютэнергиисвозбужденияразвитием(засчётувеличения числа столкновений частиц, образования нелюминесцирующихкомплексов и т.д.).

Важную роль в люминесцентных исследованиях играетучёт тушения, влияющего на интенсивность люминесценции.Множество различных механизмов, вызывающих безызлучательнуюрелаксацию состояния S 1 , приводят к процессу тушения флуоресценции.Проводят исследования с широким кругом специфических тушителейфлуоресценции, так как различные факторы воздействуют не одинаково нафлуорофоры.В качестве тушителей обычно выступают такие вещества какмолекулярный кислород, йодид, ксенон, атомы тяжелых металлов, онииндуцируют переход S 1 —› T 1 , осуществляемый в результате спинорбитального связывания.Уравнение (1.6) при наличии тушителя А, взаимодействующего сфлуоресцирующим веществом было описано [4,5] и имеет вид:Q 2 = Г /(Г + κ + κ A ∙[A]),(1.7)где [А] – концентрация тушителя; κ A – константа скорости тушения веществаА.14Из формулы (1.7) видно, что значение знаменателя увеличивается, авеличина квантового выхода уменьшается.

Приτ = 1/( Г + κ)(1.8)отношение уравнений (1.6) и (1.7) принимает вид:Q 1 / Q 2 = (Г + κ + κ A ∙[A]) / (Г + κ) = 1 + κ A ∙[A]∙τ.(1.9)Если взять динамическую константу тушения:K∙[A] = κ A ∙[A]∙τ,(1.10)и учесть тот факт, что для упрощения квантовый выход измеряетсяотношением интенсивностей флуоресценции без (I F ) и с тушителем (I A ), томожно получить уравнение Штерна – Фольмера, которое описывает процесстушения флуоресценции флуорофора при добавлении в раствор тушителя:I F / I A = 1 +K∙[A].(1.11)График зависимости (I F /I A ) – 1 от [A] представляет собой прямуюлинию с наклоном K в случае одного механизма взаимодействияфлуоресцирующего вещества с тушителем, а при наличии несколькихмеханизмов взаимодействия флуоресцирующего вещества с тушителем (илипри наличии нескольких центров связывания тушителя с флуоресцирующимвеществом) наблюдаются отклонения от линейности.§1.3.

Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей врастворахМетоды электронной спектроскопии, включающие в себя исследованиякак в ультрафиолетовой области, так и в видимой, связаны с переходамимежду различными электронными состояниями атомов и молекул. Длярассмотренияиспользуютсяэлектронныхспектрыспектровмногоатомныхлюминесценцииимолекулспектрыобычнопоглощения(абсорбционные). При поглощении квантов электромагнитного излученияосуществляются переходы из основного в возбужденные электронныесостояния в результате которых получают абсорбционные спектры.15Спектроскопия поглощения широко применяется для распознавания иопределения химической структуры биологических объектов. С помощьюметодов спектроскопии поглощения получают информацию об электронныхсостоянияхмолекул,вчастностиобэнергии,огеометрическойконфигурации, о распределении электронной плотности и о другихмолекулярных характеристиках, важных при переходе между электроннымисостояниями.Измерение интенсивности в электронных спектрах поглощениявещества в видимой и УФ областях основывается на применении законаБугера - Ламберта - Бера:I λ = I 0λ exp(-a λ cl),(1.12)где I λ - интенсивность излучения с длиной волны λ, прошедшего черезвещество; I 0λ - интенсивность излучения с той же длиной волны λ, входящегов исследуемое вещество; a λ - коэффициент поглощения для данной длиныволны (л/(моль⋅см)); c – концентрация вещества (моль/л); l – толщинапоглощающего слоя (см).В логарифмической форме, переходя к десятичным логарифмам иопуская подстрочный индекс λ, получаем выражение:A = εcl,(1.13)где A – оптическая плотность или погашение (A=lgI 0 /I); ε - коэффициентпогашения или экстинкции.Величина, равная отношению интенсивности прошедшего света черезобразец к интенсивности падающего света, называется пропусканием T:T = I/I 0 .(1.14)Следовательно, оптическая плотность связана с пропусканием:A=lg1/T.(1.15)Зависимость коэффициента экстинции ε вещества от длины волны λявляетсяспектромпоглощения.Онсостоитизнесколькихперекрещивающихся широких полос для сложных молекул.