Диссертация (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТим. М.В. ЛОМОНОСОВАФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиКулешова Анна АлександровнаФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОМАРКЕРОВСЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНЫХАЛЬБУМИНОВСпециальность:01.04.05 – оптика03.01.02 – биофизикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучные руководители:доктор физико-математических наук,профессор А. М. Салецкийкандидат физико-математических наук,старший преподаватель И.М.

ВласоваМосква – 2016ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ……………….………………………………………………….…..4ГЛАВА I. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЛУОРЕСЦЕТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ СБИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ (ПО ДАННЫМЛИТЕРАТУРЫ)….……………………………………………………………..12§1.1. Физические основы флуоресцентной спектроскопии...….….……….....12§1.2. Элементы теории тушения флуоресценции.………………..………........14§1.3.

Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей врастворах ………………………………………………………………………...15§1.4. Флуоресцентные наномаркеры семейства флуоресцеина………..….….19§1.5. Сывороточные альбумины (человеческий, бычий)………...……….…..21§1.6.Применениефлуоресцентныхнаномаркероввисследованияхбиологического материала……………………………………………………....23ГЛАВА II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА ………………………….…..31§2.1. Приготовление растворов наномаркеров семейства флуоресцеина дляизучения их флуоресцентных характеристик в растворах альбуминов(бычьего, человеческого)……………………………………………….……….31§2.2.

Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярнойассоциации и угла между молекулами в ассоциации …………….…..............31§2.3. Измерение спектрально - люминесцентных характеристик растворовнаномаркеров.………....................................................................………...…….32ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ …………………………………………....……...35§3.1.Спектральныехарактеристикифлуоресценциинаномаркеровврастворах альбуминов …....…………………………………………………......35§3.2.Флуоресцентныефлуоресцеинавхарактеристикирастворахальбуминов.наномаркеровТушениесемействафлуоресценциинаномаркеров........................................…………………………………….…....43§3.3.

Концентрационное тушение флуоресценции наномаркеров семействафлуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов ......…………………..522§3.4. Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина вбелковых растворах………....…………………………………………………...60§3.5. Вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах белка......................................................................................................86ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ……………………..…….........98ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………………...1053ВВЕДЕНИЕАктуальность и степень разработанности темыОдной из важнейших задач современной физики является изучениебиологического материала. С помощью спектроскопических методовпроводятся активные исследования по реализации быстрого мониторингаизменения состояния клеток, белков, тканей и остальных биологическихобъектов, осуществляемые при небольших количествах исследуемогообразца.

Метод флуоресцентных наномаркеров (красителей) с каждым годомвсё активнее применяется в физике, медицине, фармакологии и биологии, таккак позволяет получать информацию об исследуемом материале заминимальныесрокибезинвазивноговоздействия.Спомощьюфлуоресцентной спектроскопии исследуют, в частности, как нативнуюструктуру белков (сывороточных альбуминов), так и процессы их обратимойи необратимой денатураций, различные модификации их структуры приизменении окружающей внешней среды.Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) являютсяосновными белками плазмы крови, в плазме крови человека значение егоконцентрации около 50 г/л. Сывороточный альбумин синтезируется в печении секретируется её клетками в кровь.

Размеры молекул альбумина невелики,но концентрация высока, и он определяет коллоидно-осмотическое давлениев плазме. Сывороточные белки (человеческий и бычий) имеют похожуюструктуру, так как принадлежат одному гомологическому семейству белков.Молекулы сывороточных альбуминов состоят из цепочки аминокислотныхостатков: человеческий насчитывает 585 аминокислотных остатков, бычий –582. Эти небольшие глобулярные белки обладают схожим значениемизоэлектрической точки pI (для сывороточного альбумина человека еёзначение составляет 4,7; для бычьего – 4,9). При соответствующих pH вовторичнойструктуре оба белкаимеютприблизительноодинаковыесодержания регулярных структур.4Одной из основных функций данных белков является транспортфизиологических метаболитов, переносимых кровью, чему способствуетбольшая площадь поверхности множества молекул альбумина.

Сам механизмсвязыванияобширногокругалигандовопределяетсяналичиемусывороточных альбуминов специфических участков - связывающих центров.Естьцентры,отвечающиезасвязываниясионамиметаллов,сдлинноцепочечными жирными кислотами, с лигандами со свободной SHгруппой.ЗначительныйинтереспредставляютIиIIцентры(неспецифические лекарственные центры связывания), присоединяющиемалые органические молекулы.Большую роль в изучении физико – химических свойств связывающихцентровбелковиграетметодфлуоресцентныхнаномаркеров(люминесцентных зондов), чрезвычайно чувствительных к малейшимизменениям окружающей белка среды.

Флуоресцентная спектроскопияпозволяет анализировать данные подобных трансформаций, сигналов иизменений. На основе которых появляется возможность моделировать каккартинкуконформационногоизмененияструктурыбелков,такнепосредственно и сам механизм взаимодействия сывороточных альбуминовс лекарственными препаратами.Цели и задачи работыЦель настоящей работы заключалась в исследовании спектральнофлуоресцентных,спектрально-поляризационныхиабсорбционныххарактеристик наномаркеров семейства флуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) врастворах САЧ и БСА для различных pH среды и определении параметровповедениянаномаркеров,связанныхсбелками.Всоответствииспоставленной целью в работе были изучены следующие основные задачи.1. Измерение спектрально-флуоресцентных характеристик наномаркеровв растворах сывороточных альбуминов при различных концентрацияхи значениях pH.

Анализ изменений этих характеристик в растворахбелков и установление их природы.52. Проведение анализа процессов тушения флуоресценции наномаркеровфлуоресцеина и его галоген – производных в растворах САЧ и БСАпри разных pH и определение параметров этих процессов: константысвязывания с белками и коэффициента кооперативности.3. ИсследованиефлуоресцеинаспектроввпоглощениярастворахСАЧинаномаркеровБСАприихсемействаразличныхконцентрациях и значениях pH. Анализ процессов молекулярнойассоциации молекул красителей. Определение эффективности такихпроцессов, структуры ассоциатов и влияния белков на процессыкомплексообразования.4. Измерение спектров поляризованной флуоресценции наномаркеров.Определение параметров вращательной диффузии наномаркеров врастворах САЧ и БСА при варьировании pH.Методы и методология исследованияОсновнымметодом,используемымвработе,являетсяметодфлуоресцентной спектроскопии, позволяющий получить информацию овзаимодействиифлуоресцентныхкрасителейссывороточнымиальбуминами.

Измерения осуществлялись при комнатной температуре приразличных значениях pH растворов. Для получения спектров флуоресценциииспектровпоглощениябылииспользованыспектрометриспектрофлуориметр фирмы Perkin Elmer. Анализ полученных спектров иданных осуществлялись с помощью современных методов и программ пообработке спектров, использующих математические алгоритмы.Основные положения, выносимые на защиту1. Длинноволновое смещение спектров флуоресценции наномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов связанос изменением дипольного момента молекул при возбуждении.Замещение атомами брома, йода, хлора в структуре флуоресцеинавызывает в ряду Ф → Э → Эр → БР изменение конфигурации и жесткости6ядерной системы и, как следствие, увеличение дипольного моментамолекул при возбуждении.2.

Увеличениезначениястепенианизотропиифлуоресценциинаномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ или БСАобусловленосвязыванием наномаркеров с белками, вызывающимуменьшение вращательной диффузии для галоген - производныхфлуоресцеина более чем на порядок.3. Уменьшение вращательной диффузии для 3,5 < pH < 8,0, как вбуферных растворах, так и в растворах САЧ или БСА в ряду Ф → Э →→ Эр → БР связано с увеличением электроотрицательности радикаловбоковых групп молекул в том же порядке.4. Одинаковый характер спектрально-флуоресцентных зависимостей изакономерностей для констант связывания наномаркеров семействафлуоресцеина с САЧ и БСА от значения pH объясняется тем фактом,что зависимость зарядов обоих альбуминов от pH имеет практическиидентичный характер, с той лишь разницей, что БСА положительнозаряжен при pH< 4,9 и отрицательно заряжен при pH> 4,9, а САЧ вцелом положительно заряжен при pH< 4,7 и отрицательно заряжен приpH> 4,7.5.

Уменьшение степени молекулярной ассоциации наномаркеров иизменение структуры ассоциатов в растворах САЧ и БСА связано суменьшением их степени сродства к молекулам зондов (коэффициенткооперативности n < 1). Поэтому молекулы наномаркеров связываютсятолько с одним связывающим центром сывороточных альбуминов и кнему уже не могут присоединяться другие молекулы красителя,которые не могут также присоединяться к остальным центрам. Врезультате в среде, окружающей белок, концентрация молекулкрасителяуменьшаетсяинаблюдаетсяуменьшениестепениассоциации.76. Нелинейный характер концентрационного тушения флуоресценцииFнаномаркеров (зависимостей Штерна – Фолмера  0 − 1Fот[Q ] )обусловлен наличием нескольких типов механизмов (ковалентный,ионный) образования комплекса флуоресцентный краситель – белок.Достоверность и апробация результатовВоспроизводимостьрезультатов,ихэкспериментальным исследованиям и даннымполученныхипроанализированныхсоответствиеизвестнымобеспечивает достоверностьданных.Пополученнымвдиссертационной работе результатам была опубликованы 23 печатныеработы, из которых 7 – статьи в рецензируемых журналах, входящие в составперечняВАК.Такжерезультатыпредставленынароссийскихимеждународных конференциях: “Week of Doctoral Students 2013”(WDS 2013),Прага, Чешская Республика (4-7 июня, 2013); XVII, XVIII, XIX , XX и XXIвсероссийские конференции «Структура и динамика молекулярных систем»,Яльчик, Россия (28 июня – 2 июля, 2010; 4-9 июля, 2011; 25-30 июня, 2012;24-29 июня, 2013; 22-27 июня, 2014); XVII и XVIII международныеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальнымнаукам «Ломоносов», Москва, Россия (12-15 апреля, 2010; 11-15 апреля,2011); VII, VIII международные конференции «Фундаментальные проблемыоптики» Санкт-Петербург, Россия (15-19 октября, 2012; 20-24 октября, 2014);VIII международная конференция молодых ученых и специалистов “Оптика2013” Санкт-Петербург, Россия (14 – 18 октября, 2013); V и VI Троицкиеконференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк,Россия (4-8 июня, 2012; 2-6 июня, 2014).Научная новизнаНаучная новизна данной работы определяется выбором комплексабиологическихобъектов(бычьегосывороточногосывороточногоальбуминачеловека)иальбуминафлуоресцентныхикрасителейсемейства флуоресцеина (флуоресцеина, эозина, эритрозина и бенгальского8розового), что позволяет сравнить полученные результаты для двухразличных белков, понять, насколько будут отличаться данные приэкспериментальнойработесживотнымсывороточнымбелкомичеловеческим, и определить какие факторы будут оказывать влияние примоделировании связывания биологического материала с наномаркерами.Данный выбор позволил получить ряд важных результатов.1.