Автореферат (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов)

На правах рукописиМАКАРОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧРАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГОТИМОЗИНА БЕТА-4 ЧЕЛОВЕКА И ЕГО АНАЛОГОВ03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание учёной степеникандидата химических наукМосква -2017Работа выполнена на кафедре биотехнологии и промышленной фармации Институтатонких химических технологий Федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Московский технологическийуниверситет» и лаборатории биотехнологии Федерального государственного бюджетногоучреждения науки «Институт биоорганической химии имени академиков М.М.

Шемякинаи Ю.А. Овчинникова Российской академии наук».Научный руководитель:кандидат химических наук,Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки «Институт биоорганическойхимии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН»Официальные оппоненты:профессор, доктор химических наук, профессорхимического факультета Федеральногогосударственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования «Московскийгосударственный университет имениМ.В.Ломоносова»доктор биологических наук, ведущий научныйсотрудник Федерального государственногобюджетного учреждения «Федеральный научноисследовательский центр эпидемиологии имикробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения РФВедущая организация:Федеральное государственное бюджетноеучреждение наукиЕсипов Роман СтаниславовичКлячко Наталья ЛьвовнаЛунин Владимир ГлебовичИнститут молекулярной генетикиРАНЗащита диссертации состоится « 5 » июня 2017 г.

в 15 ч. 00 мин. на заседаниидиссертационного совета Д 212.131.06 на базе Федерального государственногобюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московскийтехнологический университет» (МИТХТ) по адресу: 119571, Москва, проспектВернадского, д. 86, ауд. М-119.С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайте ВАК РФhttp://vak.ed.gov.ru/ и Интернет-сайте https://www.mirea.ru/.С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Московский технологический университет» по адресу: 119454, Москва, проспектВернадского, д.

78 и на Интернет-сайте https://www.mirea.ru/.Автореферат разослан «____» __________ 2017 г.Ученый секретарьдиссертационного советак.х.н., с.н.с.Лютик Алла Игоревна2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ*Актуальность проблемы. Открытие тимозинов в середине 1960-х годов произошлов ходе исследований роли тимуса в развитии иммунной системы позвоночных.Тимозинами были названы небольшие белки, первоначально выделенные из вилочковойжелезы, но как стало известно из дальнейших исследований, большинство из этих белковприсутствует во многих тканях организма. Среди тимозинов пептид тимозин бета 4 (Тβ4)считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно, наиболеебиологически активным членом семьи бета тимозинов.

Благодаря тому, что молекула Тβ4является актин-связывающим пептидом, она регулирует полимеризацию актина, и, какследствие, регулирует клеточную миграцию, которая важна для процесса ангиогенеза,регенерации повреждённых тканей. В разных клеточных моделях и на уровне организманеоднократнобылопоказано,чтомолекулаТβ4обладаетуникальнымикардиопротекторными свойствами, принимает участие в стимулировании ангиогенеза вусловиях ишемии сердечной мышцы, блокирует в кардиомиоцитах проапоптотическиекаскады и, наоборот, активизирует внутриклеточные сигнальные пути, ответственные завыживаемость клеток в условиях стресса.

Регенерационный потенциал молекулы Тβ4активно исследуется и в других областях медицины. Активность этой молекулыпроявляется при лечении трофических язв, ран и ожогов роговицы глаза человека.Благодаря противовоспалительным свойствам Тβ4 зарекомендовал себя как действующеевещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи – хроническихдерматитов.Учитывая модулирующее влияние Tβ4 на клеточную дифференцировку, миграцию,регенерацию и другие процессы в организме, активно исследуются способы примененияпептида в составе лекарственных препаратов различной направленности.Исследование биораспределения Tβ4 по основным органам мыши выявило, чтоконцентрация Tβ4 в сыворотке крови мыши падает до исходного состояния уже через 40мин после введения пептида, а через 2 часа Tβ4 практически полностью выводится изорганизма,поэтому в настоящее времяперспективным направлением являетсясовершенствование лекарственных форм на основе Tβ4 с устойчивой и пролонгированнойактивностью.С точки зрения технологии производства Тβ4 в настоящее время, существуетнесколько способов его получения: выделение из природных источников или*В анализе работы при её прохождении и при подготовке работы к защите принимал участие председательдиссертационного совета академик РАН, д.х.н., проф.

Швец В.И.3синтетический подход с использованием химических и микробиологических методовсинтеза. Биотехнологический способ получения Тβ4 с использованием экспрессиирекомбинантного гена в бактериальных клетках E. coli является достаточно эффективными экологически безопасным по сравнению с химическим синтезом, однако существующиена сегодня биотехнологические методы получения целевого пептида громоздки и не всостоянии обеспечить получение нативного Тβ4.АктуальнойзадачейявляетсяполучениеаналоговТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями.Цель исследования. Разработать эффективную биотехнологию производстварекомбинантного тимозина бета-4 человека (рекомбинантный Тβ4 человека) и егоаналогов с улучшенными фармакокинетическими показателями.Задачи исследования.1.

Разработатьэффективнуюбиотехнологиюпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2. Изучить биологическую активность рекомбинантного Тβ4 человека.3. СинтезироватьаналогирекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработать эффективный способ их очистки.4. РазработатьбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Научная новизна.1. Впервые разработана эффективная и легко масштабируемаятехнологияполучения рекомбинантного Тβ4 человека с использованием интеин-опосредованнойэкспресионнойсистемы,обеспечивающаяселективноевысокоэффективноеацетилирование рекомбинантного Тβ4 in vivo.2. Исследована биологическая активность рекомбинантного Тβ4 человека наспонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность влечении хронических заболеваний кожи.3.

Синтезированы три аналога рекомбинантного Тβ4 человека с улучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработан эффективный способ очистки аналоговрекомбинантного Тβ4 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.Практическаязначимостьработы.Сиспользованиемразработаннойбиотехнологии пилотного производства рекомбинантного Тβ4 человека была наработанаопытная партия 2,5 г рекомбинантного Тβ4 человека для медико-биологическихиспытаний. Разработанная технология ацетилирования пептида in vivo обеспечилаэффективный и экономичный способ получения рекомбинантного Тβ4 человека.4Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработанаэффективнаябиотехнологияпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2.

Биологическиеисследованияпродемонстрировалиэффективностьрекомбинантного Тβ4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.3. ПроведёнсинтезаналоговрекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработаны эффективные способы их очистки.4. РазработанбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Апробацияработы.РезультатыисследованийбылидоложенынаXXVМеждународной зимней молодёжной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2013), VI российскомсимпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Уфа, 2013), Международной научнойконференциипобиоорганическойхимии,биотехнологииибионанотехнологии,посвящённой 80-летию со дня рождения академика Ю.А.

Овчинникова (Россия, Москва,2014).Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4статьи в реферируемых научных журналах, 3 тезисов докладов на российских имеждународных конференциях, получено 4 патента.Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения; литературногообзора; материалов и методов исследований; описания собственных исследований;результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; спискалитературы. Работа изложена на 100 страницах, включая 46 рисунков, 9 таблиц. Списокцитируемой литературы содержит 185 источника.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ1.РазработкабиотехнологиипилотногопроизводстварекомбинантногоТβ4человека.В лаборатории биотехнологии ИБХ РАН была разработана технология получениярекомбинантного Тβ4 человека и на её основе создана лабораторная методика.Сконструирован штамм-продуцент E.