Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина), страница 11

%Содержание звеньев N-оксидав сополимере, мол. %Среднемассовая молекулярнаямасса, кДаТаблица 5Условия проведения процесса N-оксидирования и свойства полученныхполностью N-оксидированных сополимеровПараметрыПараметры синтезаРеакционная средаТемпература, оСНомер серии субстанции160114060214050314Ацетатныый буферный раствор рН 4,480-8179-8080-8200037,135,834,932,534,835,3Свойства субстанцииСодержание звеньев 2-М-5-ВПв сополимере, мол. %Содержание звеньев N-оксидав сополимере, мол. %Среднемассовая молекулярнаямасса, кДа71Данныесериинаработанывсоответствиистехнологическойсхемой,представленной на рисунке 52.Рис. 52. Технологическая схема синтеза N-оксидов сополимераТехнология синтеза N-оксидов сополимера представлена в лабораторномрегламенте на субстанцию (Приложение 7).72ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 31.Получены шесть серий субстанций N-оксида сополимеров 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона c разной степенью оксидирования.Формулы и способ получения защищены евразийскими патентами №027934частично N-оксидированный сополимер и №027979 полностью N-оксидированныйсополимер (Приложения 3 и 4).2.Оценено влияние температуры и среды проведения реакции на ходпроцесса.

Показано, что для проведения реакции без контроля рН-системы синтезнеобходимо вести в ацетатном буферном растворе с рН 4,4 при температуре 80°Сдля достижения 100% N-оксидирования и при 65°С для получения частично Nоксидированных сополимеров.3.Методом13С ЯМР спектроскопии оценена структура вещества.Сигналы расшифрованы при помощи спектральной базы SDBS и двумерногогетероядерного спектра {13C;1H} HETCOR. Найдены величины химическихсдвигов используя в качестве модельного соединения N-оксида 2-метил-5этилпиридина.4.Предложен экспрессный метод контроля полноты протекания реакции– УФ-спектрофотометрия. Показана корреляция данного метода с методомС13ЯМР спектроскопии (коэффициент корреляции более 0,9).5.Предложена технологическая схема получения субстанций N-оксидасополимеров в составе лабораторного регламента (Приложение 7).73ГЛАВА 4.

СВЯЗЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТ СТЕПЕНИОКСИДИРОВАНИЯ СОПОЛИМЕРА N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА И2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА4.1. Изучение антигенной активностиДлявыбораоптимальнойстепениN-оксидированияисследуемыхсополимеров необходимо было провести биологические испытания, позволяющиевыявить сополимеры, обладающие большей биологической активностью.На базе филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава РФ в г. Уфа«Иммунопрепарат» были проведены эксперименты по выявлению прироста титраспецифических антител после внутрибрюшинного введения беспородным белыммышам гриппозной вакцины с новыми иммуноадъювантами – N-оксидамисополимеров 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона разной степениоксидирования.

В состав препарата входили гемагглютинин вируса гриппаподтипов А(Н1N1) и А(Н3N2), гемагглютинин вируса гриппа типа В, консервант –мертиолят и три типа адъювантов (Совидон®, частично N-оксидированныйсополимер и полностью N-оксидированный сополимер). На основании полученныхданных была изучена антигенная активность N-оксида сополимера полностью ичастично (50% пиридиновых звеньев) N-оксидированного.

Полученные значенияантигенной активности сравнивали с показателями, полученными для вакцин,содержащих в качестве иммуноадъюванта исходный сополимер 2-метил-5винилпиридинаиN-винилпирролидона.Нижепредставленатаблица6характеризующий связь титра РТГА (реакция торможения гемагглютинации) отстепени N-оксидирования сополимера. Количество иммуноадъюванта внесенногов вакцину составляет 250 и 500 мг на дозу (0,5 мл) [20]. Отчет о сравнительнойоценке Вакцины X (частично N-оксидированный сополимер ИМ1), Вакцины Y(полностью N-оксидированный сополимер ИМ2) и вакцины Совигрипп попоказателю «Антигенная активность» представлен в приложении.74Таблица 6Сравнительная оценка иммуноадъювантов по показателю антигеннаяактивностьИммуноадъювантКоличествоТип вирусаИммуноадюванта,Титр РТГА (неменее 1:40)мгсополимерА( Н1N1)1:80метил-5-А( Н3N2)1:80винилпиридина иB1:40А( Н1N1)1:160А( Н3N2)1:160B1:80А( Н1N1)1:160А( Н3N2)1:160B1:80А( Н1N1)1:320А( Н3N2)1:320B1:160А( Н1N1)1:80А( Н3N2)1:80B1:40А( Н1N1)1:160А( Н3N2)1:160B1:802- 250N-500винилпирролидона50%N-оксид 250сополимера500100%N-оксид 250сополимера500Как видно из таблицы 6 N-оксид сополимера, N-оксидированный на 50%обладает большей антигенной активностью, что делает его более перспективнымдля дальнейшего использования в качестве фармацевтической субстанции.754.2.

Определение иммуногенной активностиОсновными методами профилактики и лечения распространенных и особоопасных инфекционных заболеваний животных и птиц в ветеринарии являютсямассовая вакцинация и антибиотикотерапия. Во многих случаях эти средства недают желаемого результата. Поэтому учеными постоянно проводятся масштабныеисследования по поиску новых эффективных вакцин и способов повышения ихактивности.В последние годы обоснованное внимание уделяется получению к изучениювысокомолекулярныхполимеров,обладающихиммуностимулирующейииммуномодулирующей активностями, которые используются в комплексе сосредствамиспецифическойпрофилактикиилечения,увеличиваяихэффективность [38].Целью данного исследования являлась оценка иммуностимулирующегодействия веществ «50% N-оксид сополимера» обозначен в отчете «Викодон–40» и«100%N-оксидсополимера»обозначенвотчете«Викодон–100»прииспользовании в составе живой вакцины против сибирской язвы животных.

Вкачестве модельных животных использовали морских свинок. Отчет о результатахиспытаний иммуностимулирующего действия веществ «Викодон-40» и «Викодон100» представлен в приложении.Сравнительная оценка иммуностимулирующего действия веществ «50% Nоксид сополимера» и «100% N-оксид сополимера» на морских свинках проводитсяпосле его однократного введения за 14 дней до вакцинации и одновременно свакцинацией по величине изменения средне-эффективной иммунизирующей дозы(ЕД50), защищающей 50 % привитых животных от заражения сибиреязвеннымреференс-штаммом 71/12 в дозе 200 ЛД50.Методоснован на сравнительномопределении 50 %-ной средне-эффективной иммунизирующей дозы (ЕД 50) вакцины с применением и безприменения иммуностимулятора [1].Расчет концентрации жизнеспособных спор штамма в 1 см 3 разведеннойвакцины проводят по формуле:76СN n  N n1 1• • 10 n1,1Vгде: С – число жизнеспособных спор в 1,0 см3 вакцины (млн);N n - среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при посевеиз разведения 10-5;N n 1 - среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при посевеиз разведения 10-6;1,1 – постоянный коэффициент;V – объем вакцины, высеваемой на чашки;10n – разведение вакцины.В1см3разведеннойвакциныдолжносодержаться20–25млн.жизнеспособных спор.Далее проводили определение LD50 для морских свинок референсзаражающей культуры штамма 71/12.Величина LD50 рассчитывается по формуле Кербера в модификацииИ.П.Ашмарина и А.А.Воробьева:lgLD50 = lgDN – δ(Li – 0,5),где: DN - максимальная из испытанных доз,δ – логарифм кратности испытанных разведений,Li – отношение числа животных, павших от введения данной дозы, к общемучислу животных, которым эта доза была введена.Послепроведенияподготовительныхработ,описанных вышебылоопределено иммуностимулирующее действие веществ «50% N-оксид сополимера»и «100% N-оксид сополимера» по изменению показателя средне-эффективнойиммунизирующей дозы (ЕД 50) на морских свинкахЕД50 испытуемой группы вычисляют по формуле:nlg ЕД 50  lg Dn   ( Li  0,5)i 1илиnlg ЕД 50  6,699  0,699( Li  0,5)i 177где: Dn – максимальная из испытанных доз;6,699 – логарифм максимальной иммунизирующей дозы (5 млн.

спор); – логарифм кратности испытанных разведений;0,699 – логарифм шага разведения препарата равного 5;Li – отношение числа живых животных, выживших после заражения, кобщему числу морских свинок, которым были введены дозы испытуемогопрепарата;i – индекс, соответствующий номеру дозы;0,5 – постоянный коэффициент.В зависимости от количества выживших морских свинок могут быть полученыследующие значенияn Li и соответствующие им величины ЕД50, указанные вi 1таблице 7.Таблица 7Определение иммуностимулирующего действия сополимеров по изменениюпоказателя средне-эффективной иммунизирующей дозы (ЕД 50) Lilg ЕД50 Lilg ЕД501,06,34952,242,235,41750,261,166,23301,712,505,30100,201,336,11641,312,665,18450,151,506,00001,02,835,06800,121,665,88350,763,004,95150,091,835,76700,583,164,83500,072,05,65040,453,334,71850,052,165,53400,343,504,60200,04ni 1ЕД50 в млн.спорni 1ЕД50 в млн.спорВеличина ЕД50 вакцины для испытуемых групп животных не должнапревышать величину ЕД50 для вакцины, без применения веществ «50% N-оксидсополимера» и «100% N-оксид сополимера».Также была изучена иммуногенная активность путем определения LD50 для78морских свинок референс-заражающей культуры штамма 71/12.

Результатыпредставлены в таблице 8.Таблица 8Определение ЛД50 референс-заражающей культуры штамма 71/12ДозаКол.Дни наблюдения (пало)заражения, голов 123456Пало/ Li78910∑Liвсеготыс.спор6255--325/511255--325/51255--1214/50,855--1315/5115--11------2/50,40,25---1-----11/50,24,4Таким образом, ЛД50 штамма 71/12 для морских свинок равно 1180 спор.Определение иммуностимулирующего действия веществ «50% N-оксидсополимера» и «100% N-оксид сополимера» было проведено по изменениюпоказателя средне-эффективной иммунизирующей дозы (ЕД50)на морскихсвинках.