Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина), страница 8

Испытуемый раствор N-оксида сополимера такжеготовили посредством растворения в ацетонитриле. Концентрация раствора Nоксида сополимера составила 50 мг/мл.Пригодность хроматографической системы определяли по следующимпараметрам:эффективностьколонки,разрешениемеждупикамидвуханализируемых компонентов, относительное стандартное отклонение площадейпиков и коэффициент асимметрии.Бутилацетат и циклогексанПрипроизводствеисходногосополимера,которыйвдальнейшемподвергается N-оксидированию используются бутилацетат и циклогексан. Ихсодержание контролируется методом ГЖХ с использованием метилциклогексанакак внутренний стандарт. Прибором для анализа выступал отечественный49комплекс аппаратно-программный для медицинских исследований на базехроматографа «Хроматэк - Кристалл 5000».Газом-носителем являлся азот, расход воздуха составил 400 мл/мин, расходводорода 40 мл/мин с делением потока 0,05. Разделение проводили на неполярнойколонке CR-5, 30м*0,32мм*0,5мкм, при температуре 75 оС.

На входе в колонкудавление составляло 8 psi. Пробу объемом 1 мкл вносили в испарительпредварительно нагретый до 170оС, а затем детектировали при помощи пламенноионизационного детектора при 150 оС.В качестве внутреннего стандарта выступал метилциклогексан, готовили егораствор растворяя 20 мг в спирте этиловом в количестве 100 мл, полученныйраствор имеет концентрацию 0,2 мг/мл. Стандартный раствор готовят следующимобразом: Циклогексан в количестве 7,5 мг (точная навеска) и бутилацетат вколичестве 10 мг (точная навеска) вносят в мерную колбу объемом 10 мл, и доводятдо метки раствором внутреннего стандарта.

Полученный раствор разбавляли вдесять раз раствором внутреннего стандарта и анализировали в условиях,описанных выше. Испытуемый раствор N-оксида сополимера также готовилипосредством растворения в растворе внутреннего стандарта. Концентрацияраствора N-оксида сополимера составила 50 мг/мл.Пригодность хроматографической системы определяли по следующимпараметрам:эффективностьколонки,разрешениемеждупикамидвуханализируемых компонентов, относительное стандартное отклонение площадейпиков и коэффициент асимметрии.• Родственные примеси: α-пирролидон и N-винилпирролидонИсходный сополимер, N-оксидированию которого посвящена данная работавключает в свой состав звенья пирролидона. В процессе полимеризации исходногосополимера остаются непрореагируемые мономеры, которые являются примесямидля исходного сополимера и N-оксида сополимера.

Количество данныхродственных примесей контролируется методом газо-жидкостной хроматографииПрибором для анализа выступал отечественный комплекс аппаратно-программныйдля медицинских исследований на базе хроматографа «Хроматэк - Кристалл 5000».50Газом-носителем являлся водород, расход воздуха составил 250 мл/мин,расход водорода 25 мл/мин с делением потока 0,2. Разделение проводили наполярной колонке SOLGET-WAX, 30м*0.32мм*0.5мкм, при температурномградиенте от 165 до 200оС.

Пробу объемом 1 мкл вносили в испарительпредварительно нагретый до 250оС, а затем детектировали при помощи пламенноионизационного детектора при 260 оС.Стандартный раствор готовят следующим образом N-винилпирролидон вколичестве 100 мг (точная навеска) и α-пирролидон в количестве 150 мг приливаютв мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки спиртом этиловым.Испытуемый раствор N-оксида сополимера также готовили посредствомрастворения в спирте этиловом. Концентрация раствора N-оксида сополимерасоставила 50 мг/мл.Пригодность хроматографической системы определяли по следующимпараметрам:эффективностьколонки,разрешениемеждупикамидвуханализируемых компонентов, относительное стандартное отклонение площадейпиков и коэффициент асимметрии.2.2.1.4.

Ионная хроматографияОсновными объектами, определяемыми методом ионной хроматографии,являются неорганические ионы. Ионная хроматография – раздел ионообменнойхроматографии, в которой ионы разделяются посредством ионного обмена. Ионыразделенные посредством хроматографических процессов детектируются впроточном кондуктометрическом детекторе.

Данный детектор является достаточночувствительным, поэтому крайне важным является обеспечение невысокойфоновой электропроводности потока жидкости. Для этого используют две колонки,расположенныепоследовательно.Подавлениеэлектролитапроисходитвионообменной колонке, расположенной между колонкой на которой идетразделение и детектором [32].51• Родственные примеси: Ацетат-ионыКоличественное определение ацетата натрия в водных растворах N-оксидасополимера проводили методом ионной хроматографии.

Анализ проводили нахроматографе «Стайер» (Аквилон) с насосом AI-12 (Flom) с генератором элюента,электрохимическим подавителем EMCE’21 (Аквилон), кондуктометрическимдетектором CD-510 (Аквилон) и инжектором 7125 (Rheodyne), с использованиемколонки ICSep AN2 4.6×250мм. Программа обработки данных – «Мультихромv.3.4» (Амперсенд).2.2.1.5. ЯМР спектроскопия на ядрах углерода13СВещества, ядра атомов которых имеют магнитные моменты, в постоянноммагнитном поле поглощают энергию электромагнитных волн (радиочастотныйдиапазон) при определенном соотношении между величинами постоянногомагнитного поля и частотой переменного поля (ядерный магнитный резонанс,ЯМР). Данным методом возможно установление подлинности вещества иопределение количества посторонних примесей.

[8]• Подлинность субстанции N-оксида сополимера, родственныепримеси, оценка полноты протекания реакции N-оксидирования,содержание доли звеньев N-оксидаГотовят раствор анализируемой субстанции N-оксида сополимера сконцентрацией 100 мг/мл в воде дейтерированной (дейтерия оксид). Объем пробынеобходимой для анализа 1 мл. Полученный раствор тщательно перемешивают ипереносят в ампулу для регистрации ЯМР спектров диаметром 5 мм ирегистрируют ЯМР спектр на ядрах углеродаС на ЯМР спектрометре Bruker13DPX-300 в режиме Inverse Gate.

Рабочая частота на протонах не менее 200 МГц,температура проведения анализа 30 оС (303 К), число сканирований 200, задержкамежду импульсами не менее 30 секунд. Для отнесения пиков используютвнутренний стандарт натриевую соль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты.2.2.1.6. РефрактометрияМетод исследования веществ, основанный на определении показателяпреломления (коэффициента рефракции) и некоторых его функций. Применяется52для идентификации химических соединений, количественного и структурногоанализа, определения физико-химических параметров веществ [9].• Количественное определение субстанции N-оксида сополимераИсследуемую субстанцию N-оксида сополимера в количестве 2,5 г (точнаянавеска) помещают в мерную колбу объемом 50 мл, растворяют в 25 мл водыдистиллированной и интенсивно перемешивают.

Водой дистиллированной доводятраствор до метки, концентрация раствора субстанции N-оксида сополимерасоставляет50мг/мл.Вкачестверастворасравнениявыступаетводадистиллированная. Раствор субстанции N-оксида сополимера термостатируюттечение 20 минут при 20 ± 0,1 °С. Проверяют пригодность прибора по водедистиллированной, показатель преломления которой, в данных условияхсоставляет 1,3300. Блок призм также термостатируют при заданных условиях,промывают спиртом этиловым и протирают стеклянные поверхности следя за темчтобы не осталось посторонних включений на анализируемой области.2.2.1.7.

УФ-спектрофотометрияУФ-спектрофотометрия основывается на измерении количества поглощениявеществом электромагнитного излучения в определенной узкой волновой области.Обычно для УФ – измерений используют приближенно монохроматическоеизлучение в области от 200 до 800 нм [22].• Контроль степени полноты реакции N-оксидирования сополимера,содержание доли звеньев N-оксидаВ ходе проведения реакции N-оксидирования сополимера отбирали 200 мклреакционной массы, помещали в мерную колбу на 200 мл и добавляли водыдистиллированной до метки и перемешивали. Регистрировали УФ-спектры вдиапазоне от 190 до 350 нм. Раствор сравнения вода дистиллированная.Спектрофотометр СФ-104 с программным обеспечением UVWin (ЗАО «Аквилон»,Россия)532.2.2.

Методы контроля качества субстанции сополимера N-оксида2.2.2.1. Родственные примеси: Перекисные соединенияЙодометрическое титрование позволяет определить количество перекисныхсоединений в субстанции N-оксида сополимера. Испытания проводят следующимобразом: точную навеску N-оксида сополимера массой 1 г количественнопереносят в коническую колбу объемом 50 мл, прибавляют 5 мл 10 % растворакислоты серной и 10 мл воды. В течении 20 минут выдерживают полученныйраствор, после чего приливают 5 мл 10 % раствора калия йодида, и оставляютраствор в темном месте на 40 минут.

За указанное время происходит выделениейода, который в дальнейшем титруют 0,01 М раствором натрия тиосульфата,используя в качестве индикатора 0,1 % раствора крахмала.2.2.2.2. Подлинность субстанции сополимера N-оксидаИспользуя цветные качественные реакции проводили испытания на звеньяпирролидона и пиридина входящие в состав субстанции сополимера N-оксида.Навеску субстанции сополимера N-оксида в количестве 1 г (точная навеска)растворяли в 100 мл воды дистиллированной. Полученная концентрация раствора1%. В пробирку помещают 2 мл полученного раствора и добавляют 2 мл кислотыпикриновой насыщенный раствор.

Во вторую пробирку добавляют 2 мл растворасубстанции сополимера N-оксида и 2 мл раствора йода.2.2.2.3. Весовая доля звеньев 2-метил-5-винилпиридина в субстанциисополимера N-оксидаВ качестве метода определения применяли потенциометрическое неводноетитрование. Среда растворения N-оксида сополимера пропионовый ангидрид,титрант 0,1 н раствор кислоты хлорной в ледяной уксусной кислоте. Точкаэквивалентности устанавливается потенциометрически. Навеску субстанции Nоксида сополимера 250 мг (точная навеска) помещают в мерную колбу на 50 мл,добавляют 30 мл пропионового ангидрида, растворяют при постоянномперемешивании, а затем доводят до метки пропионовым ангидридом. Проводяттитрование в системе, описанной выше, с использованием серебряного электродакак индикаторного, и каломельного как электрода сравнения. Каломельный54электрод заполняется насыщенным раствором калия хлорида в пропионовомангидриде.2.2.2.4.

Прозрачность и степень мутности раствора субстанциисополимера N-оксидаПрозрачность и степень мутности раствора субстанции сополимера N-оксидаопределяли путем сравнения испытуемой жидкости с растворителем (вода) илиэталонами визуальным методом или инструментальным методом (ГФ XIII, ч.1,ОФС.1.2.1.0007.15). Концентрация испытуемого раствора 0,1%. ИзмеренияпроводилиспомощьюпортативногомутнометраHACH-2100QPortableTurbidimeter.2.2.2.5. Степень окраски раствора субстанции сополимера N-оксидаСтепень окраски раствора субстанции сополимера N-оксида определяютвизуально путем сравнения с соответствующими эталонами.

Исходя из внешнеговида субстанции необходимо использовать эталоны B, Y и BY приготовленные поГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.1.0006.15. Концентрация испытуемого раствора 0,1%. Дляоценки степени окраски раствора использовали пробирки 0,2 см в диаметре избесцветного стекла. В данные пробирки наливали растворы на 4 см от дна.Растворителем образцов являлась вода дистиллированная. Оценку проводят,наблюдая цвет раствора смотря сверху на слой жидкости, при дневном освещении.Пробирки устанавливают на белой подложке.2.2.2.6. рН раствора субстанции сополимера N-оксидаОпределение рН раствора субстанции сополимера N-оксида проводилисогласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.1.0004.15.