Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»МИНИСТЕРСТВА ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИРОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИНа правах рукописиВОРФОЛОМЕЕВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНАПОЛУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХВОДОРАСТВОРИМЫХ СОПОЛИМЕРОВ НА ОСНОВЕN-ОКСИДОВ ПИРИДИНА14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозияДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИКАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУКНАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬдоктор технических наук,профессор Кедик С.А.МОСКВА – 20182ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕОСНОВНАЯ ЧАСТЬГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Классификация современных адъювантов1.2. Получение N-оксидов пиридина1.3. Применение N-оксидов пиридинаВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследования2.1.1. Действующее вещество2.1.2. Исходные и вспомогательные вещества2.2. Методы исследования2.2.1. Физико-химические методы анализа N-оксида сополимера2.2.2. Методы контроля качества субстанции N-оксида сополимера2.2.3. Биологические методы2.2.4. Статистическая обработка данных, валидация аналитическихметодикГЛАВА 3.

СИНТЕЗ СОПОЛИМЕРА N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА С 2МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНОМ И 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНN-ОКСИДОМ3.1. Синтез исходного соединения – сополимера N-винилпирролидона с2-метил-5-винилпиридином3.2. Получение N-оксида сополимера3.2.1. Метод контроля степени превращения реакции Nоксидирования пиридиновых звеньев3.2.2. Проведение реакции в уксусной кислоте3.2.3. Проведение реакции в буферных растворах3.2.4. Оценка влияния температуры на протекание реакции Nоксидирования3.2.5.

Оптимальные условия получения субстанцииВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 3ГЛАВА 4. СВЯЗЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТ СТЕПЕНИОКСИДИРОВАНИЯ СОПОЛИМЕРА N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА И 2МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА4.1. Изучение антигенной активности4.2. Определение иммуногенной активностиВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 44101010254042434343434545535658595960606163646972737375803ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВАN-ОКСИДА СОПОЛИМЕРА 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА ИN-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА5.1.

Специфические методы анализа субстанции5.1.1. Содержание доли звеньев N-оксида5.1.2. Содержание доли звеньев 2-метил-5-винилпиридина5.1.3.Определениемолекулярно-массовыххарактеристиксубстанции сополимера N-оксида5.2. Общие методы анализа субстанции5.2.1. Показатель подлинность5.2.2. Родственные примеси5.2.2.1 Ацетаты5.2.2.2. Перекисные соединения5.2.2.3. α-пирролидон и N-винилпирролидон5.2.3. Остаточные органические растворители5.2.3.1. Бутилацетат и циклогексан5.2.3.2. Четыреххлористый углерод и хлороформ5.2.4. Количественное определение5.3.

Стабильность субстанции сополимера5.4. Проект спецификацииВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5ЗАКЛЮЧЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙСПИСОК ЛИТЕРАТУРЫПРИЛОЖЕНИЯПриложение 1. Акт внедрения «Московский технологическийуниверситет»Приложение 2. Акт внедрения ЗАО «Институт фармацевтическихтехнологий»Приложение 3. Евразийский патент №027934Приложение 4. Евразийский патент №027979Приложение 5. Проект НД на субстанцию «Викодон – оксид»Приложение 6.

Протоколы валидацииПриложение 7. Лабораторный регламент на субстанциюПриложение 8. Отчеты по изучению иммуностимулирующего действияи антигенной активности субстанции818181828485858586898990901001011041071111121141151331341361381391401441481494ВВЕДЕНИЕАктуальностьПо данным Роспотребнадзора за 2017 год около 20 % заболеваний,приводящих к летальному исходу, являются инфекционными.

В качествепрофилактики данной группы заболеваний можно отметить искоренение очагаинфекции, введение карантина, повышение сопротивляемости организма ивакцинирование [36].Вакцинация – создания специфической невосприимчивости к инфекционнымзаболеваниям путем моделирования естественного инфекционного процесса сблагоприятным исходом.

В некоторых случаях входящие в состав вакцины,ослабленные или убитые микроорганизмы, обладают слабой иммуногенностью. Сцелью усиления иммунного ответа со стороны иммунной системы человека всостав современных вакцин вводят различные иммуноадъюванты. Их применениепозволяет снизить себестоимость вакцины и свести к минимуму побочныеэффекты.В последнее время получили широкое распространение полимерныеиммуноадъюванты: сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)1,4-этиленпиперазиний бромида и сополимер N-винилпирролидона и 2-метил-5винилпиридина, позволяющие вызвать ранний иммунный ответ, уменьшитьтоксичностьиувеличитьантигеннуюактивностьвакцины.Вкачествеиммуноадъюванта в составе гриппозной вакцины хорошо себя зарекомендовалсополимер N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина [26].

Технологияполучения вакцин ограничивает возможный диапазон рН показателями от 7.0 до 7.6,соответствующий значению рН физиологических жидкостей. В этой областизначений рН для сополимера 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона(МПВ и N-ВП) с высоким значением пиридиновых звеньев наблюдается разделениефаз, что затрудняет стадию фильтрования в технологическом процессе. В работахКедика С.А. и сотрудников показано, что с ростом числа пиридиновых звеньев вмакромолекулах сополимера его иммуноадъювантная активность возрастает, приэтом растворимость сополимера в воде уменьшается [13-15]. В литературе описаны5пути увеличения растворимости подобных соединений, одним из которых являетсямодификация сополимеров N-оксидированием пиридиновых звеньев [12].

Такимобразом, поиск, получение и стандартизация новых биологически активныхиммуноадъювантов с улучшенными технологическими свойствами являетсяактуальной задачей.Степень разработанности темыМетодики синтеза и химические свойства N-оксидов описаны в монографииКатрицкого А.Р. «Химия гетероциклических N-оксидов» (1971). В работахНижника Я.П. (2004) и Митянова В.С. (2014) большое внимание уделено методамполучения N-оксидов и изучению реакций комплексообразования N-оксидов сразличными соединениями. В работе Кацнельсон Б.А.

и Алексеева О.Г. (1995)описанырезультатыпримененияN-оксидовпиридинадлялеченияпневмокониозов.В работе Кедика С.А. и сотрудников (2012) показана биологическаяактивность сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, поэтомупредполагалось, что N-оксид данного сополимера, сохранит высокую биологическуюактивность, при улучшенных показателях растворимости. Также в указанных работахотсутствуют какие-либо данные о стандартизации полученных веществ, что непозволяетиспользоватьполученныеN-оксидыдляфармацевтическойпромышленности.Целью работы является синтез растворимых в воде сополимеров Nвинилпирролидонас2-метил-5-винилпиридином,N-оксидированныхпопиридиновым звеньям, и исследование их иммуноадъювантной активности.Для реализации поставленной цели были сформулированы следующиезадачи:• Выбрать N-оксидирующий агент, позволяющий провести направленныйсинтез сополимеров.• Изучить влияние рН и температуры на кинетику реакции N-оксидированияпиридиновыхзвеньеввинилпиридином.сополимеровN-винилпирролидонас2-метил-5-6• Разработать метод контроля степени превращения реакции N-оксидированияпиридиновых звеньев.• Выбрать оптимальную степень N-оксидирования пиридиновых звеньевсополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина с помощьюбиологической модели и анализа растворимости полученных производных.• Разработать методы контроля качества для выбранного сополимера N-оксида2-метил-5-винилпиридина с N-винилпирролидоном и провести их валидацию.• Подготовить проект нормативной документации для субстанции сополимераN-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридин-N-оксида.Научная новизна работыВ ходе работы изучена реакция N-оксидирования пиридиновых звеньевсополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина.

Из литературных иэкспериментальных данных выбран оптимальный N-оксидирующий агент.Исследовано влияние температуры и рН среды на скорость и полноту протеканияреакции.Разработанспектрофотометрическийметодконтроляполнотыпротекания реакции, основанный на гипсохромном смещении максимума полосыпоглощения. Показано, что данные спектрофотометрического метода хорошокоррелируют с данными, полученными методомС ЯМР спектроскопии.13Установлена корреляция между степенью N-оксидирования пиридиновых звеньевсополимераиN-винилпирролидона2-метил-5-винилпиридинасиммуноадъювантной активностью и растворимостью. Разработаны методыконтроля качества сополимера N-винилпирролидона с 2-метил-5-винилпиридин-Nоксидом.

Проведена сравнительная оценка иммуностимулирующего действиясополимераN-винилпирролидонаи2-метил-5-винилпиридин-N-оксидаповеличине изменения средне-эффективной иммунизирующей дозы (ЕД 50).Теоретическая и практическая значимость• Получена оригинальная субстанция сополимера N-винилпирролидона и 2метил-5-винилпиридина, N-оксидированного по пиридиновым звеньям(Евразийский патент №027934, №027979).7• Подобраныусловиясинтезадляосуществленияконтролируемогопроцесса N-оксидирования и возможного выбора степени превращения вещества.• При помощи методов13С ЯМР спектроскопии и УФ-спектрофотометриипроведен анализ структуры сополимеров N-винилпирролидона с 2-метил-5винилпиридин-N-оксидом.• Разработаны методы контроля качества субстанции сополимера Nвинилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридин-N-оксида (проект нормативнойдокументации (НД), апробированный ЗАО «ИФТ» 23.11.2017) для дальнейшегоиспользования ее в качестве лекарственного средства иммуномодулирующегодействия.• Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс кафедрыбиотехнологииипромышленнойфармацииФГБОУВО«Московскийтехнологический университет» Министерства образования и науки РоссийскойФедерации (акт внедрения от 12.01.2018).Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтическихнаук.