Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина), страница 12

Результаты количественной оценки иммуногенной активности штамма55-ВНИИВВиМ на морских свинках по изменению величины средне-эффективнойиммунизирующей дозы, защищающей 50 % животных после введения 200 ЛД 50референс-заражающей сибиреязвенной культуры, представлены в таблице 9.Таблица 9Результаты определения ЕД50 на морских свинкахГруппаДоза,Кол-ПалоКол-воживотныхспор/свопослезараженных /всегом3живот вакци50%N-оксид 10 млнныхнации40Выжиложивотных33/3∑Li ЕД50,тыс.

спор79сополимера за 14 2 млн4133/3до 400 тыс 4132/380 тыс3031/3N-оксид 10 млн4033/34033/3до 400 тыс 4031/380 тыс3032/3N-оксид 10 млн4133/34032/3одновременно с 400 тыс 4033/3вакцинациейднейвакцинации100%сополимера за 14 2 млнднейвакцинации50%сополимера2 млн80 тыс3032/3N-оксид 10 млн4133/34132/3одновременно с 400 тыс 4131/3вакцинацией100%сополимера2 млн80 тыс4131/3Вакцина сер.01- 10 млн4033/34031/3400 тыс 4032/380 тыс3031/3-3-30/32 млн15Контроль3,090,02,66 150,03,33 50,02,33 2402,33 240,0--Таким образом, введение субстанции «50% N-оксид сополимера» как за 14дней до вакцинации, так и одновременно с вакцинацией снижает показатель ЕД 50вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ B.

anthracis в 2,66 и 4,8 раза, соответственно.Величина средне-эффективной дозы вакцины при применении вещества «100% Nоксид сополимера» незначительно снижалась только в случае его введения за 14дней до вакцинации (в 1,6 раза), а его применение одновременно с вакцинациейпрактически не влияет на формирование защитного иммунитета.80ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 41. Получены значения антигенной активности вакцин, содержащих вкачестве иммуноадъюванта исходный сополимер 2-метил-5-винилпиридина и Nвинилпирролидона и его N-оксид с разной степенью оксидирования.

50% N-оксидобладает большей антигенной активностью, что делает его более перспективнымдля дальнейшего использования в качестве фармацевтической субстанции.2. Изучена иммуногенная активность: определен показатель ЕД50 вакцины изштамма 55-ВНИИВВиМ B. anthracis при применении вещества «100% N-оксидсополимера» и «50% N-оксид сополимера» в разные периоды вакцинации и безприменения иммуноаъюванта.

Субстанция 50% N-оксид сополимера при введенииза 14 дней до вакцинации снижает показатель ЕД50 вакцины в 2,66 раз, присовместном введении в 4,8 раз. 100% N-оксид сополимера снижает величинусредне-эффективной дозы вакцины в 1,6 раза при введении за 14 дней довакцинации, использование субстанции одновременно с вакцинацией практическине влияет на формирование защитного иммунитета.81ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВАN-ОКСИДА СОПОЛИМЕРА 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА ИN-ВИНИЛПИРРОЛИДОНАНа основании биологических данных, а также данных по растворимости Nоксидов сополимеров для дальнейшей стандартизации и использования в качествефармацевтическойсубстанциииспользоваличастичноN-оксидированныйсополимер со степенью N-оксидирования 50%.5.1.

Специфические методы анализа N-оксида сополимераСубстанциясополимерапредставляетN-оксидасобойаморфный,гигроскопичный порошок белого цвета с желтоватым оттенком, обладающийслабым характерным запахом. N-оксид сополимера очень легко растворим в воде,в этиловом спирте легко растворим, очень мало растворим в циклогексане. Данныйобъект представляет интерес в качестве фармацевтической субстанции.

В связи сэтим необходима разработка методов контроля качества субстанции сополимера Nоксида и составление отдельных разделов нормативной документации [8, 77]5.1.1. Содержание доли звеньев N-оксидаВ сополимере N-оксиде содержание доли звеньев N-оксида должно быть впределах 17-20 мольных процентов. Методом 13С ЯМР спектроскопии определенадоля звеньев N-оксида в сополимере.

На рисунке 53 представлен спектр N-21020019018017016015014013047.21545.11944.31142.13637.46734.58531.08430.24527.88023.18017.56016.570147.635141.405140.355138.046137.685137.177130.394127.468181.107177.397215.147оксидированного сополимера 2-метил-5-винилпириридина и N-винилпирролидона.120110100908070605040Рис.53.13С ЯМР спектр N-оксидированного сополимера3020 ppm82Учитывая,чтопропорциональнаинтегральнаямольномуинтенсивностьсодержаниюсигналасоответствующегокаждогоатомафрагментавсополимере, для расчёта степени N-оксидирования можно предложить следующуюформулу:С2∗= ∗∙ 100%2 + 2I 2 – сигнал С пиридинового2гдекольцаI 2*– сигнал С2 пиридиновогокольца в N – оксиде5.1.2. Содержание доли 2-метил-5-винилпиридиновых звеньевДоля 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев в N-оксиде сополимера должнасоставлять от 17 до 20 мольных процентов. В качестве метода определенияприменяли потенциометрическое неводное титрование.

Среда растворения Nоксида сополимера пропионовый ангидрид, титрант 0,1 н раствор кислоты хлорнойвледянойуксуснойкислоте.Точкаэквивалентностиустанавливаетсяпотенциометрически.Эквивалентный объем титранта, соответствующий эквивалентной точкетитрования, находят графически по максимуму на дифференциальной кривойзависимости ΔE/ΔV от V, который находят экстраполяцией ее ветвей, исходя из еесимметричности.Весовую долю (Х) звеньев 2-метил-5-винилпиридина находят по формуле:= ∙ 0,1 ∙ ( − 0 ) ∙ [МВП]; ∙ 1000 ∙ –коэффициент нормальности кислоты хлорной– объем 0,1 н кислоты хлорной, пошедшей на титрование холостогораствора, мл0 – объем 0,1 н кислоты хлорной, пошедшей на титрование навески N-оксидасополимера.[МВП ] –молекулярная масса звена 2-метил-5-винилпиридина, равная 119,16г/моль.83– навеска сополимера, г.– содержание основного вещества в сополимере, мас.д.В ходе проведения эксперимента были определены графические зависимостиобъема кислоты хлорной, пошедшей на титрование от электродного потенциала(рис.54) и определения точки эквивалентности.

(рис.55).700E, mV600500400300200100V, мл0012345Рис.54. Зависимость объема титранта от потенциалаΔE/ΔV700600500400300200100V, мл0012345Рис.55. Дифференциальная зависимость ΔЕ/ΔV от объема раствора длятитрования84Были проведены испытания трех серий субстанции сополимера N-оксида,позволившие определить диапазон возможных значений содержания доли звеньев2-метил-5винилпиридина в субстанции сополимера N-оксида от 17 до 20 мол.%.5.1.3.

Определение молекулярно-массовых характеристик субстанциисополимера N-оксидаДля определения молекулярно-массового распределения (ММР) субстанциисополимера N-оксида была разработана методика эксклюзионной хроматографии сприменениемрефрактометрическогодетектирования.Составэлюентаобеспечивает полную растворимость сополимера и минимальное взаимодействиепоследнего с неподвижной фазой.При анализе стандартов с помощью эксклюзионной хроматографии былиполучены данные для построения калибровочной прямой и построена сама прямая(рис. 56).5,1y = -0,1761x + 5,76024,94,74,54,34,13,93,73,54,55,56,57,58,59,510,511,5Рис. 56. Калибровочная прямая для определения ММР N-оксида сополимера85Рис. 57.

Хроматограмма N-оксида сополимераБыли проведены испытания трех серий субстанции сополимера N-оксида,позволившиеопределитьдиапазонвозможныхзначенийсреднемассовоймолекулярной массы от 30 000 до 40 000 Да. Значения средней низкомолекулярнойфракции (10%) не менее 200 Да, средней высокомолекулярной фракции не более50 тыс. Да.5.2. Общие методы анализа субстанцииПоскольку N-оксид сополимера планируется использоваться в качествефармацевтической субстанции необходима его стандартизация по следующимпоказателям: посторонние примеси, остаточные органические растворители,подлинность, количественное определение.5.2.1.

Показатель подлинностьИспользуя цветные качественные реакции, описанные в главе 2, проводилииспытания на звенья пирролидона и пиридина входящие в состав субстанциисополимера N-оксида, наблюдается появление творожистого осадка желтого цвета,что характерно для звеньев пиридина, и коричневого осадка, что характерно длязвеньевпирролидона.ЗвеньяN-оксидаоценивалиметодомС13спектроскопии по наличию сигналов ядер углерода в области 125-175 м.д.ЯМР-865.2.2. Родственные примеси5.2.2.1.

АцетатыСинтезсополимераN-оксидавинилпириридинапроводиливN-винилпирролидонасредеуксуснойкислоты,и2-метил-5-послестадийнейтрализации и очистки, в субстанции определяли остаточное количествоуксусной кислоты и ее солей при помощи 13С ЯМР-спектроскопии.Рис.58. 13С ЯМР спектр N-оксидированного сополимераДля расчета процентного содержания ацетатов в субстанции предложенаформула:Y(%)= ∙ук9 ∙ПВП +2 ∙ВП + ∙ук∙ 100%;где , 9 , 2 – сигналы ядер углерода, в уксусной кислоте, вполивинилпирролидоне и винилпиридине N-оксиде, номера соответствуютхимической схеме протекания реакции.ук , ПВП , ВП- молекулярная масса уксусной кислоты 60 г/моль,молекулярная масса поливинилпирролидонового звена 111 г/моль и молекулярнаямасса звена винилпиридина N-оксида равная 119 г/моль.87Оптимизация анализа ацетатного аниона методом ионной хроматографииНапервомэтапеисследованиявкачествеэлюентабылвыбранэлектрохимически генерируемый раствор KOH подаваемый с расходом 1,2 мл/мин.Была проведена проверка разделения смеси анионов в стандартных условиях, токгенератора составлял 28 мА.