Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина), страница 9

Испытанию подвергали 1% водныйрастворсубстанцииопределениерНсополимерасистемыN-оксидапроводили,вводе.используяПотенциометрическоерН-метр"Эксперт-рН"снабженный измерительным преобразователем, комбинированным рН-электродомЭСК-10601/7 и температурным датчиком. Пригодность прибора оценивалась позначению рН растворов из набора стандарт-титров.2.2.2.7. Сульфатная зола субстанции сополимера N-оксидаОпределение сульфатной золы субстанции сополимера N-оксида проводили55согласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.2.2.0014.15. Субстанцию сополимера N-оксида вколичестве два грамма количественно переносили в тигель, с известнойпостоянной массой, добавляли 1 мл кислоты серной концентрированной инагревали до состояния обугливания.

После этого тигель прокаливали вмуфельной печи при температуре 600°С, до исчезновения остатка субстанции.Пепел, оставшийся в тигле, взвешивают и рассчитывают процентное содержаниесульфатной золы.2.2.2.8. Тяжелые металлы в субстанции сополимера N-оксидаОпределение тяжелых металлов в субстанции сополимера N-оксидапроводили согласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.2.2.0012.15. Тяжелые металлыопределяли в зольном остатке субстанции, полученном после испытания насульфатную золу. Пепел, оставшийся в тигле после прокаливания субстанции вмуфельной печи, обрабатывали раствором ацетата аммония, добавляли водыдистиллированной и фильтровали, используя беззольный фильтр. В полученныйраствор добавляли раствор уксусной кислоты и натрия сульфида и сравнивалиокраску с эталонными растворами.2.2.2.9.

Потеря в массе при высушивании субстанции сополимера NоксидаОпределение показателя потеря в массе при высушивании субстанциисополимера N-оксида проводили согласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.1.0010.15. Навескусубстанции сополимера N-оксида массой 500 мг помещают в предварительновысушенный до постоянной массы бюкс и сушат при 100 оС в сушильном шкафу допостоянной массы.2.2.2.10. Пирогенность субстанции сополимера N-оксидаОпределение пирогенности субстанции сополимера N-оксида проводилисогласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.4.0005.15.

Животные, выбранные для испытания –кролики. Объем вводимого раствора 0,5 мл на 1 кг массы тела испытуемогокролика. Концентрация вводимого раствора 1 %. Растворитель субстанции –апирогенная вода.562.2.2.11. Микробиологическая чистота субстанции сополимера N-оксидаОпределение микробиологической чистоты субстанции сополимера Nоксида проводили согласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.2.4.0002.15. Исследуемаясубстанция относится к категории 1.2.Б., что включает в себя требование«Стерильность»–стерильныелекарственныепрепараты,подвергшиесястерилизации.2.2.2.12.

Изучение сроков годности субстанции сополимера N-оксидаИзучение сроков годности субстанции сополимера N-оксида проводилисогласно ГФ XIII, ч.1, ОФС.1.1.0009.15. Для субстанции сополимера N-оксидапроводили долгосрочные испытания стабильности в течении двух лет, а такжеиспытание стабильности методом «ускоренного старения». Для проведенияиспытаний субстанцию сополимера N-оксида помещали в полимерные пакеты.2.2.3. Биологические методыВ качестве испытуемых животных выступали морские свинки массой30050г, беспородные, в количестве 108 голов. Испытания проводили, используявакцину против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ, субстанциюсополимера N-оксида – стандартизированные 2% растворы «50% N-оксидсополимера» и «100% N-оксид сополимера», в качестве референс-заражающейкультуры был выбран возбудитель сибирской язвы – штамм 71/12 2-ой вакциныЦенковского (для морских свинок) изготовленный 21.03.2014 г.

Питательныесреды и растворы, используемые в испытаниях: мясопептонный бульон (МПБ),мясопептонный агар (МПА), забуференный физиологический раствор (ЗФР), твин80.На первом этапе исследования было необходимо определить количествожизнеспособных спор. Содержимое ампул вакцины разводят забуференнымфизиологическим раствором (ЗФР) до рабочего разведения так, чтобы 1 см3приготовленного рабочего разведения соответствовал одной прививочной дозевакцины (20–25 млн.

спор). Разведенную вакцину тщательно перемешивают ипараллельно из каждой пробы (флакона) готовят ее десятикратные разведения (с5710-1 до 10-6) на жидкости для разведения (к 100 см 3 стерильной дистиллированнойводы добавляют 2 капли Твина-80). Затем тщательно перемешивают два последнихразведений вакцины (10-5 и 10-6), начиная с меньшего, делают высевы в чашкиПетри с мясопептонным агаром (МПА) стерильной микропипеткой. Из каждогоразведения высев проводят на три чашки с агаром, внося по (0,1±0,01) см 3суспензии.Покачивая,равномернораспределяютпосевнойматериалпоповерхности агара, чашки Петри подсушивают 30-40 минут при комнатнойтемпературе и переносят в термостат на 20-24 часа при температуре (37±1) °С. Поистечении указанного времени визуально проводят подсчет колоний, выросших наагаре в каждой чашке Петри и находят среднее арифметическое число колонийкаждого разведения вакцины.Затем находят иммуногенную активность субстанции сополимера N-оксидапутем определения LD50 для морских свинок референс-заражающей культурыштамма 71/12.

Для определения LD50 референс-заражающей культуры штамма71/12 тридцати клинически здоровым морским свинкам массой 30050 г,содержащимся на полноценном рационе однократно подкожно в области животавводят по 0,50,05 см3 суспензии спор, содержащей 625 тыс., 125 тыс., 25 тыс., 5тыс., 1 тыс. спор и 200 спор штамма 71/12. Каждую заражающую дозу вводят 5морским свинкам. Наблюдение за животными осуществляют в течение 10 сутокпосле заражения. Всех погибших животных вскрывают и делают высевы методомотпечатков печени, селезенки, легких, лимфатических узлов на плотнуюпитательную среду.

Заболевшими сибирской язвой считаются только те животные,от которых из внутренних органов была выделена культура B. anthracis. Морскиесвинки разбиваются на пять групп по 15 голов в каждой: – первой и второй группамживотных субстанции «50% N-оксид сополимера» и «100% N-оксид сополимера»,соответственно, вводят за 14 дней до вакцинации в объёме 0,5 мл в дозе 1 мг/кг; –третьей и четвертой группам животных субстанции «50% N-оксид сополимера» и«100% N-оксид сополимера», соответственно, вводят одновременно с вакцинациейв объёме 0,5 мл в дозе 1 мг/кг;– пятой группе субстанции «50% N-оксидсополимера» и «100% N-оксид сополимера» не вводятся.

Вакцину разводят58стерильным физиологическим раствором до рабочего разведения. Затем готовятразведения из стерильного физиологического раствора содержащим 10 млн., 2млн., 400 тыс. и 80 тыс. живых спор в одном кубическом сантиметре.Приготовленными разведениями суспензий спор вакцины иммунизируют по 15 (накаждую группу) клинически здоровых морских свинок массой 30 50 г подкожнов области живота в объеме по 0,5 см3.

Тремя первыми дозами споровой культурывакцинируют по 4, а одной меньшей последней дозой – по 3 головы, для того чтобык моменту заражения живыми были не менее 3 морских свинок в каждой группе.Через 14 суток после вакцинации по 3 морских свинки, привитых каждой дозойспоровых культур и 3 не привитых клинически здоровых морских свинки заражаютстандартной референс-заражающей сибиреязвенной культурой - подкожно вобласти живота вводят по 0,50,05 см3 в дозе 200 ЛД50.

Наблюдение за животнымиосуществляют в течение 10 суток после заражения. Всех погибших животныхвскрывают и делают высевы методом отпечатков печени, селезенки, легких,лимфатических узлов на плотную питательную среду. Заболевшими сибирскойязвой считаются только те животные, от которых из внутренних органов былавыделена культура B. anthracis. Все не иммунизированные морские свинки должныпогибнуть в течение 10-ти суток. Допускается выживание одного непривитогоживотного.2.2.4. Статистическая обработка данных, валидация аналитическихметодикДанные полученные в результате исследований обрабатывались в программеMicrosoft Office Excel 365. Метрологические характеристики рассчитывалисогласно ГФ XIII изд.

«Статистическая обработка результатов химическогоэксперимента» (ОФС.1.1.0013.15)[8].Валидациюаналитических методикопределения субстанции N-оксид сополимера оформляли в соответствии сдокументациейГФ(ОФС.1.1.0012.15).XIIIизд.«Валидацияаналитическихметодик»59ГЛАВА 3. СИНТЕЗ СОПОЛИМЕРА N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА С 2МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНОМ И 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИН -NОКСИДОМ3.1. Синтез исходного соединения – сополимера N-винилпирролидона с 2метил-5-винилпиридиномИсходный сополимер 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидонаполучали радикальной сополимеризаций 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП) иN-винилпирролидона (N-ВПД).

В качестве инициатора полимеризации выступалазобисизобутиронитрил, пероксид водорода и циклогексан применяли в качестверегулятора молекулярной массы. Для протекания реакции мольное соотношении 2метил-5-винилпиридина к N-винилпирролидону должно составлять 1 к 37, данноесоотношение необходимо поддерживать в течении всего синтеза, добавляяиспользующиеся мономеры.