Диссертация (Получение и стандартизация биологически активных водорастворимых сополимеров на основе N-оксидов пиридина), страница 7

Исходя из этогорекомендованы для клинического применения препараты с молекулярной массойот 40 до 60 тыс. дальтон. Они обладают высокой эффективностью и не создаютчрезмерного накопления в организме. Способ введения предпочтительнеевнутривенный (капельный) и аэрозольные ингаляции [29].42ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 11. В ходе настоящего информационного анализа установлено, чтосовременные адъюванты имеют различный состав и способ действия, но при этомне обладают всеми желаемыми свойствами, для использования их в составе вакцин.Адъюванты, входящие в состав современных вакцин, имеют природное исинтетическоепроисхождение.Относящиесякприроднымадъювантамминеральные соли, тензоактивные соединения, производные микроорганизмоввысокотоксичны для человека и применяются в крайних случаях. Синтетическиепрепараты, в виду возможности их направленной модификации обладаютменьшими побочными эффектами, при выраженном терапевтическом действии.Стандартизация полимерных адъювантов также является важным направлениемфармацевтической отрасли.2.

Показаны способы получения новых перспективных адъювантов на основеN-оксидов, включающие в себя: направленный синтез существующих N-оксидов ссохранением N-оксидной группы, формирование кольца из нециклическогосоединения, содержащего N-оксидную группу, а также прямое N-оксидированиесоответствующего гетероциклического соединения.Наоснованиилитературныхданныхвыбранпереченьнадкислотиспользуемых, в дальнейшем при синтезе N-оксидов сополимера.3.

Исследование N-оксидов проводимые ранее, установили терапевтическоевлияние адъювантов на их основе на организм животных и человека. Введение Nоксида поливинилпиридина существенно уменьшает риск фиброза, вызванногопопаданием кварцевой пыли в легкие. Поливинилпиридин-N-оксид обладаетингибирующим действием на макрофаги, благодаря чему наблюдается замедлениесиликоза в случае даже его однократного введения.

Зависимость терапевтическогодействия от молекулярной массы на данный момент не выявлена, но ввиду того чтовысокомолекулярные полимеры (более 100 тыс. дальтон) задерживаются ворганизме, для клинического применения рекомендованы полимеры и сополимерыс молекулярной массой от 40 до 60 тыс. дальтон. Таким образом разработка истандартизация новых адъювантов является актуальной задачей.43ГЛАВА 2.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследования2.1.1. Действующее веществоОбъектом исследования являлась оригинальная биологически активнаясубстанция, представляющая собой сополимер N-винилпирролидона с 2-метил-5винилпиридином и 2-метил-5-винилпиридин-N-оксидом. Содержание мономерныхзвеньев (m+k) 37 ± 3 мол. %, при этом доля мономерных звеньев (k) составляет0,05·(m+k)–0,95·(m+k)сополимера2-метил-5-винилпиридинаиN-винилпирролидона.

Среднемассовая молекулярная масса Mw = 30000 – 40 000 Da[23, 37]. Формула и способ получения вещества защищены евразийскимипатентами №027934 и 027979 (приложения 3 и 4).Рис.37. Структура N-оксида сополимераОписание. Аморфный, гигроскопичный порошок от белого до желтоватогоцвета со слабым специфическим запахом, электризуется.Растворимость. Очень легко растворим в воде, в спирте легко растворим,умеренно растворим в хлороформе.

Практически нерастворим в циклогексане.2.1.2. Исходные и вспомогательные веществаСополимер 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона с содержаниеммономерных звеньев m 37± 3 мольн.%. Синтезирован совместно с ЗАО «ИФТ»попатенту №2000004 [23, 27].44Рис.38. Структурная формула сополимера 2-метил-5-винилпиридина иN-винилпирролидонаБутилацетат. Бесцветная жидкость, незначительно растворимая в воде,хорошо смешивается с органическими растворителями. Температура кипения126,3°C [8].Циклогексан. Бесцветная жидкость с характерным запахом. Молярная масса84,16 г/моль.

Температура плавления 6,5°С, температура кипения 79–81°С [8].Ледянаяуксуснаякислота.Прозрачная,бесцветнаялетучая,легковоспламеняющаяся жидкость с резким специфическим запахом и кислымвкусом. Гигроскопична. Смешивается с водой, этиловым спиртом в любыхсоотношениях. Молекулярная масса 60,05 г/моль, плотность 1,0492 г/см3,температура кипения 118,1 °C 8Перекись водорода.Бесцветная,прозрачнаяжидкость беззапаха.Смешивается в любых соотношениях с водой, растворима в спиртах, диэтиловомэфире. Является сильным окислителем. Молекулярная масса 34,01 г/моль,плотность 1,4 г/см3, температура кипения 150,2 °C 8.Надуксусная кислота. Бесцветная жидкость с резким запахом. Растворимав воде и органических растворителях. Обладает сильным окисляющим эффектом.Молекулярная масса 76,05 г/моль, плотность 1,1037 г/см³, температура кипения110 °C.

8452.2. Методы исследований2.2.1. Физико-химические методы анализа N-оксида сополимера2.2.1.1. Высокоэффективная жидкостная хроматографияВысокоэффективная жидкостная хроматографияпозволяет проводитьразделение сложных смесей веществ. Метод отличается экспрессностью, котораядостигается благодаря использованию высокого давления. В основе разделениялежит различие в сродстве анализируемых компонентов к подвижным инеподвижным фазам.• Количественное определение субстанции сополимера N-оксидаКоличественное определение субстанции сополимера N-оксида проводилиметодом ВЭЖХна хроматографе «Dionex UltiMate 3000» (Thermo Scientific,Германия) оснащенном диодной матрицей и флуориметрическим детектором,дегазатором, термостатом колонок, автосамплером и насосом, позволяющимработать в градиентном режиме.

Программа обработки Chromeleon 6.8. Составподвижной фазы изменяется в соответствии с программой градиента (таблица 2).Таблица 2Режим градиентаВремя, мин012910,310,517Фаза В, %0035656500Фазой А являлся 5 ммолярный водный раствор пентансульфоната натрия сдобавкой 1% ортофосфорной кислоты, фаза В – ацетонитрил.

Скорость потокаподвижной фазы – 1 мл в минуту.В качестве неподвижной фазы выбрали широкопористкую колонкупригодную для анализа полимеров: Jupiter 5 мкм С5 300А, 250х4.6 мм. Колонкатермостатируется при 25°С.СтандартнымобразцомявляласьсубстанцияN-оксидасополимеравысушенная до постоянной массы, и охарактеризованная по основнымпоказателям. Раствор рабочего стандартного образца готовили следующимобразом: помещают 10 мг (точная навеска) стандартного образца в мерную колбу46на 10 мл, добавляют 8 мл ПФ А растворяют образец при перемешивании, затемдоводят до метки ацетонитрилом, концентрация раствора 1 мг/мл.Испытуемый раствор N-оксида сополимера готовили аналогичным образом.Полученныерастворыдетектирировалиприпомощидиодно-матричногодетектора, количественные характеристики получали при длинее волны 269 нм.Объем анализированных компонентов, вносимых в хроматограф составил 20 мкл.Пригодность хроматографической системы определяли по следующимпараметрам: эффективность колонки, относительное стандартное отклонениеплощадей пиков и коэффициент асимметрии.2.2.1.2.

Эксклюзионная хроматографияЭксклюзионная хроматография (Size Exclusion Chromatography, SEC)реализуется, когда поведение макромолекул в порах определяется энтропийнойсоставляющей свободной энергии, а энергетическая составляющая мала посравнениюсней.Вэтомслучае,коэффициентраспределениябудетэкспоненциально зависеть от соотношения размера макромолекулы и размера пор[32].

Поведение макромолекул в условиях эксклюзионной хроматографииопределяется размером цепи. Размер макромолекулы определяется ее химическимстроением, числом звеньев в цепи (или молекулярной массой), топологией(например, размер разветвленной макромолекулы или макроцикла уменьшается посравнению с линейной макромолекулой того же химического строения). Крометого, размер гибких макромолекул в определенной степени зависит отиспользованного растворителя благодаря эффекту исключенного объема [2].• Молекулярно-массовое распределениеМолекулярно-массовоераспределениеN-оксидасополимерабылоопределено методом эксклюзионной хроматографии.

Исследование проводили нахроматографе«Стайер»(Аквилон),данныеобрабатываливпрограмме«Мультихром». В качестве подвижной фазы был выбран состав, состоящий на 15процентов из ацетонитрила и на 85 процентов из фосфатного буферного растворарН 3,0. Подвижную фазу готовили следующим образом: 8,95 г динатриягидрофосфата и 3,40 г калия дигидрофосфата растворяют в воде и доводили объём47раствора водой до 1000,0 мл. Потенциометрически контролировали значение рН, спомощью фосфорной кислоты концентрированной, устанавливали его в диапазоне3,0±0,05. Отбирали 850 мл полученного раствора и добавляют 150 млацетонитрила, перемешивали и фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм.Подвижная фаза подается со скоростью потока 1,0 мл/минВ качестве неподвижной фазы выбрали колонку TSKgel G4000PWXL 17 µm,500Å, 7.5x300 mm, с частицами полимера покрытыми активными группами,содержащими гидроксилированный метакрилат.

Колонка термостатируется при25°С.Стандартнымиобразцамивыступалиполидисперсныестандартыполивинилпирролидона, произведенные Американской корпорацией полимерныхстандартов (APSC) со среднемассовой молекулярной массой: 5500, 12200, 14400,16800, 22100, 34900, 65900 и 95100 Da. Растворы готовили следующим образом:помещают 10 мг (точная навеска) стандартного образца в мерную колбу на 10 мл,добавляют 8 мл ПФ растворяют образец при перемешивании, затем доводят дометки раствором подвижной фазы, концентрация раствора 1 мг/мл.Испытуемый раствор N-оксида сополимера готовили аналогичным образом.Полученные растворы определяли при помощи рефрактометрического детектора.Объем анализированных компонентов, вносимых в хроматограф составил 20 мкл.Хроматографическаясистемасчитаетсяпригоднойеслизначениясреднемассовых молекулярных масс отличаются от паспортных данных на пятьи/или менее процентов.2.2.1.3.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ)Метод газожидкостной хроматографии позволяет анализировать смесивеществ, способных испарятся без разложения. Компоненты анализируемой смесидвижутся с потоком газа-носителя по хроматографической колонке. В процесседвижения смесь множественно распределяется между газом-носителем и жидкимсоставом, нанесенным на инертный материал. Неподвижной фазой могут бытьвысокомолекулярные жидкости, покрывающие стенки капиллярной колонки [40].48• Остаточные органические растворителиЧетыреххлористый углерод и хлороформПрипроизводствеисходногосополимера,которыйвдальнейшемподвергается N-оксидированию используются четыреххлористый углерод ихлороформ.Ихсодержаниеконтролируетсяметодомгазожидкостнойхроматографии Прибором для анализа выступал отечественный комплексаппаратно-программный для медицинских исследований на базе хроматографа«Хроматэк - Кристалл 5000».Газом-носителем являлся азот, расход поддувного газа составил 30 мл/мин сделением потока 0,025.

Разделение проводили на неполярной колонке CR-5,30м*0,32мм*0,5мкм, при температурном градиенте от 35 до 100 оС. На входе вколонку давление составляло 60 кПа. Пробу объемом 1 мкл вносили в испарительпредварительно нагретый до 150 оС, а затем детектировали при помощи детектораэлектронного захвата при 290 оС.Стандартный раствор готовят следующим образом четыреххлористыйуглерод в количестве 20 мг (точная навеска) и хлороформ в количестве 30 мгприливают в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетонирилом.Полученный раствор разбавляют в 100 раз ацетонитрилом и анализируют вусловиях, описанных выше.