Пташне - Переключение генов - 1988, страница 10

4 и в приложении 1. До сих пор мы обрашали внимание главным образом на те взаимодействия, которые обеспечивают специфические контакты функциональных групп ДНК и аминокислот узнающей а-спирали, а в случае Л-репрессора-аминокислот, расположенных на концах гибких «рук». Однако прочность связывания- по крайней мере частично, а может бьггь, и в основном — обусловлена взаимодействием других учао~кон белковой молекулы с ДНК.

Например, когда Л-репрессор сближается со своим оператором, белок взаимодействует с фосфатными группами остова двойной спирали ДНК, отмеченными на рис. 2.14, Этн и другие сильные взаимодействия возможны ~олько в том случае, если группы белка, определяющие специфичность„находят те группы ДНК, с которыми они должны взаимодействовать. Мы только начинаем понима~ь, какие взаимодействия о„з Рис. 2Л4. Фосфатные группы, контактирующие с репрессором, связывающимся с операторным участком О„!. Эти группы располагаются с одной стороны двойной спирали, симметрично относигедьно оси второго порядка, прото,чящей через середину оператора. С некоторыми из зтик фосфатов контактирует Сто.

боковых цепей аминокислот с основаниями обеспечивают специфическое связывание. По-видимому, в любом мономерном белке специфичность определяется пе более чем 3 — 4 аминокислотами. Всегда ли узнающая спираль в точности комплементарна ДНК, так что аминокислоты в строго определенных положениях взаимодействуют с основаниями ДНК в строго определенных положениях оператора? Существует ли простой код, описывающий взаимодействия аминокислот с основаниями". До сих пор мы рассматривали ДНК как жесткую палочку, т.е, весьма упрощенно.

Например, мы знаем, что точные параметры спиральной структуры ДНК до некоторой степени зависят от нуклеотидной последовательности. Будет ли это сказываться сколько-нибудь заметно на ДНК-белковых взаимодействиях? Не исключено, например, что основания, не контактирующие непосредственно со связанным белком, тем не менее влияют на связывание, слегка изменяя локальную структуру ДНК или ее гибкость.

Насколько важны эти факторы, мы до сих пор не знаем. Промотор Фермент РНК-полимераза Е. со1г' узнает многие промоторы, расположенные в начале самых разных генов. Напомним (см. введение), что промотор занимает около 60 пар оснований, в том числе 20 пар оснований за местом начала транскрипции (т.е. по ее ходу). Вообще говоря, двух одинаковых промоторных последовательностей не существует, но все они содержат два характерных участка: один из них расположен за 1О пар оснований до точки начала транскрипции, а второй-примерно за 35 пар оснований до этого места.

Первое основание ДНК„которое копируется в виде РНК, принято обозначать номером + 1, так что середины этих консервативных про- 5б -35 -!а и 1 3'л«л ~статс|тес|с*слит~аист|с ссл сс 5' Область -55 Область-!О Стлаискаииии ) Рис. 2.15. Консенсус-последовательность промотора. Этот промотор обеспечивает транскрипцию слепа направо. Первое транскрибирусмое оснонание обозначается ч 1; — 10 и — 35 основания, лежащие ло начала транскрипции. Консервативную тн|следовательность в области — ! О ино| да называют ТАТЛ- последовательностью. Расстояние между консервативными элементами различных промоторов [ТАТА и областью -35) колеблетсн от 15 до 18 пар оснований, причем оптимально расстояние в !7 пар.

моторных последовательностей находятся в положениях — 10 и — 35. Сравнивая последовательности многих промоторов, мы можем построить консенсус-промотор; два консервативных его участка показаны на рис. 2.15. Последовательность любого промотора в областях — 10 и — 35 более или менее сходна с этими консенсус-последовательностями. Полимераза контактирует с участками промотора, лежащими на одной стороне двойной спирали в области примерно — 10 —: — 40.

На участке от — 10 до + 1 двойная спираль раскрыта„так что одну из цепей можно скопировать в виде мРНК. Структурные особенности полимеразы, которые позволяют ей избирательно связываться с промоторами, неизвестны. Как правило, промотор, последовательность которого в областях — 10 и — 35 близка к консенсус-последовательности, хорошо работает. Но если наблюдаются сильные различия, полимераза обычно нуждается в белке-активаторе, который помогает ей связаться и начать транскрипцию. В табл. 2.3 сопоставляются промоторы )ь Рк и Р м с консенсус-последовательностью.

Для Р„наблюдается лучшее совпадение и в области — 10, и в области — 35, чем для Р Возможно, именно по этой причине РНК-полимераза эффективно связывается с Р„и начинает с него транскрипцию без всяких регуляторных белков, в то время как для связывания и транскрипции с Р„необходим дополнительный белок — ).- репрессор, связанный с 0 2, Таблица 2.3. Сравнение последовательностей промоторов фага ь с консенсус-промотором. !'азличающнеся основания выделены настом Консенсус- !5 - 1О ППОМОтОО ТтСА! А -тор-Т АТ ААт Т А С А т А — |"Пр т1 охт.-|ьт-тАтА Ат Регуляция генов Теперь мы подготовлены к тому, чтобы понять, как должны быть расположены последовательности промотора и оператора, чтобы репрессор и Сго могли действовагь так, как это описано в гл.

1. Помимо того, чго мы имеем представление о последовательностях промотора и оператора,нам известна детальная сгруктура комплексов репрессора с оператором и Сго с оператором. На рис. 2.16 приведена последовательность ДНК между генами с) и сто. Сравните этот рисунок с рис. 1.4 и обратите 'внимание на перекрывание последовательностей промоторов и оператора. Как мы уже видели в гл.

1 (рис. 1.13), если 0„ 1 занят репрессором или Сто, полимераза вытесняется с Рк, поскольку любой связанный белок закрывает часть поверхности двойной спирали, которую занимает РНК-полимераза. То же самое справедливо и для Ох 3: любой регуляторный белок блокирует связывание РНК-полимеразы с Р„„. Что касается 0„2, то здесь ситуация сложнее. Напомним (тл. 1), что 0„2 учао~ вуе~ как в позитивной, ~ак и в негативной регуляции: при связывании с этим участком репрессор выключает Р и стимулирует Р „.

Механизм негативной регуляции обычен: репрессор, связанный с Ох 2, закрывает часть поверхности ДНК, которая должна быть доступна для связывания полимеразы с Рк. Участок промотора, который покрывается репрессором, в этом случае меньше, чем при заполнении Ок 1, но даже этого достаточно для репрессии. Как же репрессор, связанный с 0„2, стимулируе~ транскрипцию? На рис. 2.!6 видно, что 0„2 на одну пару оснований ближе к Рк !считая от точки начала транскрипции), чем к Р„„.

Благодаря этому репрессор, связанный с 0„2, совершенно не закрывае~ поверхность Р, необходимую для связывания полимеразы. Вместо этого репрессор, связанный с 0„2, сближается и контактирует с РНК-полимеразой, связанной с Р . Как отмечалось в гл. 1 (рис. 1.12), это взаимодействие помогает полимеразе связаться и начать транскрипцию с Р „.

Поверхность репрессора, которая контактирует с полимеразой и осуществляет позитивную регуляцию, изображена на рис. 2.17. Конфигурация аминокислот на этом участке поверхности оптимальна для взаимодействия с полимеразой, и если их заменить. то репрессор сохранит способность связываться с Оя2, но уже не будет сзимулировать транскрипцию с Р .

Можно думать, что если бы 0 2 располагался на одну пару оснований ближе к Р „подобно тому, как он расположен относительно Р„, то репрессор, связанный с 0„2, блокировал бы связывание полимеразы с Р „, а не способствовал ему. 58 Белок Сго, связанный с 0„2, также блокирует связывание полимеразы с Ра. Сго, сидящий на Оа2, закрывае~ такую же часть Р„, как и репрессор. Если Сго связывается только с Оп 2 (это искусственная ситуация, которую можно создать экспериментально), он не в состоянии стимулировать Р„. Объясняется это тем, что, хотя Сго может занимать нужное положение, чтобы контактировать с полимеразой, он не имеет необходимых аминокислот на поверхности контакта, чтобы оказывать стимулирующее дейсгвие. Следует отметить, что рассмотрение линейных плоских изображений последовательностей операторов и промоторов может вводить в заблуждение.

Например, судя по рис. 2.1б, Оа 2 закрывает оба промотора, и Р„, и Р, так что связанный репрессор должен их оба подавлять. Анализ пространственной структуры ясно показывает, что белки могут узнавать перекрывающиеся последовательности, но связываться с разных сторон двойной спирали ДНК. Из сказанного в этой главе можно заключить, что белок подавляет промотор в том случае, когда он закрывае~ часть поверхности двойной спирали ДНК, с которой должна связываться полимераза Сугцествуют разные варианты организации последовательностей оператора и промотора, способные обеспечить репрессию, но в любом случае последовательности должны перекрываться так, чтобы каждая из них могла выполнять свою функцию.

Для позитивной регуляции необходимо взаимодействие между связанным регуляторным белком и полимеразой. На поверхности регуляторного белка, соприкасающейся с полимеразой, должны располагаться соответствующие аминокислоты, Поверхность, взаимодействующая с полимеразой, отличается от поверхности, связывающей ДНК.

Эти функции— связывание с ДНК и позитивный контроль — можно разделить два белка могут связываться с ДНК одинаковым образом, но только один из них способен к позитивной регуляции. Литература: обзоры 1 Иаа)ег Г) К МсС)иге И'Л Согпр1!а)гоп апг) апа1уяв оГ Ввсьепс)па сов ргопю)ег ГЭ)ЧА вслпспсев. Хпс! Асгг)в Кев, 11, 2237 2255 !1983) 2 Мипюгп Т, Ргивдпе М А Гу)4А орегагог-гергемог вувгею, зсг Агпег, 234, 64 76 (1976) 3 Ридо С О, 5ииег я Т Ргогс1п-Гу)ЧА гесокгппоп, Апп кои Вгосвст, 53, 293-321 !1984) 4 Ргигдпе М .)идивип А 2) Ридо Г 0 А кспепс вгигсь ~п а Ьаглепа! югпк зсг Агпег, 247, 128 †1 11982) 5 вгедеиягг Г), 5ггиргип я В, Си)дегг И' Нвсьепс)па сои ИИА ро!угпегаве ~пгегасгв Ьогпо!окоги)у пи)Ь Гпо ЙГГегеп) ргогпо)егв, Се!1, 20, 269--281 (!980) Глава 3 Регуляторные механизмы и жизненный цикл фага Многие вирусы размножаются только одним способом.